BAB IV METODOLOGI PENELITIAN

Transkripsi

1 BAB IV METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini terdiri dari 2 kegiatan penelitian, yaitu sebagai berikut : 1. Penelitian tahap I yaitu penelitian eksplorasi untuk melihat hasil modifikasi fisik kitosan memiliki karaterisasi nano partikel dan memilki kemampuan menghambat pertumbuhan C. albicans. 2. Penelitian tahap II yaitu penelitian eksperimental laboratoris untuk mengetahui hubungan konsentrasi nano kitosan terhadap pertumbuhan C. albicans. B. Sampel Penelitian dan Bahan Uji Sampel penelitian yang digunakan adalah C. albicans yang didapat dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, sedangkan bahan uji yang digunakan adalah kitosan yang diekstak dari eksoskeleton kumbang tanduk (Xylotrupes Gideon L). C. Tempat dan Waktu Pembuatan nano kitosan dilakukan di Laboratorium Biokimia Teknologi Hasil Perairan Fakultas Ilmu Perikanan dan Kelautan Institut Pertanian Bogor. Uji PSA dilakukan di Analisis bahan FMIPA, IPB. Uji Scanning Electron Microscope (SEM) dilakukan di Laboratorium Scanning Electron Microscope (SEM) Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Institut Teknologi Bandung (ITB). Uji aktivitas partikel nano kitosan dengan metode difusi dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia pada bulan April-Desember

2 D. Alur Penelitian Eksoskeleton kumbang tanduk Deproteinisasi Netralisasi Demineralisasi Netralisasi Dekolorisasi KITOSAN Kitosan dilarutkan dalam asam asetet Metode Magnetic stirer Ditambahkan emulsifier (Tween 80) 0,2% secara tetes demi tetes Didiamkan selama 30 menit Ditambahkan tripoliphospat 0,1% Didiamkan selama 30 menit Larutan Nano Kitosan Dikeringkan dengan spray dryer Uji PSA Serum Nano Kitosan yang stabil Spray dry Uji Aktivitas Antibakteri Uji SEM Difusi Mendapatkan Konsentrasi Terbaik dalam menberikan zona hambat 20

3 E. Variabel Penelitian Variable bebas : Nano kitosan yang di ekstrak dari eksoskeleton Kumbang Tanduk (Xylotrupes Gideon L) Variable tergantung : Pertumbuhan mikroorganisme C. albicans. F. Definisi Operasional Variabel 1. Xylotrupes gideon merupakan kumbang tanduk dan hama yang menyerang pucuk kelapa 2. Kitosan merupakan polimer alami yang memiliki keunggulan sebagai antijamur 3. Nano kitosan merupakan kitosan yang memiliki pertikel yang berbentuk padat dengan ukuran sekitar nm, dan mengandung gugus asetil yang rendah (melalui proses deasetilasi). Kemudian diencerkan dengan aquabidestilata menjadi bebrapa konsetrasi 3000 ppm, 2000ppm, 1000ppm, 500ppm, 250ppm (w/v) dengan menggunakan skala rasio. 4. Pertumbuhan C.albicans dalam media culture Sabouraud Dekstrosa Agar, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C, di ukur berdasarkan jumlah koloni bakteri dalam suatu CFU/satuan volume dalam skala rasio. 5. Zona hambat merupakan daerah bebas mikroorganisme yang mungkin timbul di sekitar cakram dan dinyatakan dalam millimeter (mm) dengan menggunakan skala rasio. G. Alat dan Bahan 1. Alat - Magnetic stirrer - Magnetic bar - BSC (Biosafety Cabinet) - Spektrofotometer - Neraca digital - ph universal - Tabung reaksi 21

4 - Cawan petri - Mikropipet - Batang Ose - Bunsen - Botol semprot - Vortex Mixer - Inkubator - Autoklaf - Alat ukut Mc Farland - Kertas cakram - Pipet 1 ml - Pipet 1 μl - Pinset - Batang L / spatula - Catton bud besar - Yellow tip dan blue tip - Sarung tangan dan masker steril - Lemari pendingin - Alumunium foil - Spidol marker - Cawan petri dan tabung steril - Colony Counter - Analisis FTIR (FourierbTransform infra Red) - Analisis PSA (Particle Size Analyzer) 2. Bahan - Nano kitosaneksoskeleton kumbang tanduk (Rhinoceros Beetle) - Sabouroud Dekstrosa Agar - CandidaAlbicans - NaCl8,5% - Paper disk 22

5 - Aqua bidestilata - NaOH 10% - Asam asetat 0,5% - Alkohol - Obat antijamur - Mc.Farland 1 H. Cara Kerja 1. Sterilisasi Alat dan Bahan Sterilkan alat-alat dengan alkohol atau autoklaf 2. Pembuatan Kitin/Kitosan a. Demineralisasi Penghilangan mineral dilakukan pada suhu 90 C dengan menggunakan larutan HCl 1 N dengan perbandingan sampel dengan larutan HCl = 1:7 (gr serbuk/ml HCl) sambil diaduk selama 60 menit. Kemudian disaring untuk diambil endapannya. b. Deproteinasi Proses ini dilakukan pada suhu 90 C dengan menggunakan larutan NaOH 3N dengan perbandingan serpihan serangga dengan NaOH = 1:10 (gr serbuk/ml NaOH) sambil diaduk selama 60 menit. c. Dekalorisasi Endapan hasil deproteinsasi ditambahkan dengan 4% NaOCl (w/v) selama 10 menit pada suhu kamar. Perbandingan solid dan solven 1:10 (w/v). d. Deasetilasi Proses ini dilakukan pada suhu 90 C dengan menggunakan larutan NaOH 50% dengan perbandingan serpihan serangga dengan NaOH = 1:10 (gr serbuk/ml NaOH) sambil diaduk selama 60 menit. 23

6 3. Pembuatan Nano Kitosan Kitosan yang berupa serbuk diambil sebanyak 1,5 gram, kemudian larutkan dalam asam asetat 1-2% sebanyak ml. Setelah itu, masukkan aqua bidestilata sampai volume di 500 ml. Kemudian masukkan magnetic bar 3 cm. lakukan stirrer dengan menggunakan magnetic bar selama 2 jam. Kemudian masukkan tween 0,1 % sebanyak 0,1 ml. Stirer kembali selama 30 menit. Setelah itu masukkan TPP 100 ml (drop to drop). Stirer kembali selama 1 jam. Nano kitosan selesai dan siap digunakan. Bila tidak langsung digunakan, nano kitosan dapat disimpan di tempat yang steril. Cara pembuatan pengenceran larutan nano kitosan: Rumus pengenceran M1 x V1 = M2 x V2 a. Larutan nano Kitosan 3000 ppm b. Larutan nano kitosan 2000 ppm: 1,33 ml nano kitosan dicampur 0,67 ml aquabidestilata lalu divortex. c. Larutan nano kitosan 1000 ppm : 0,67 ml nano kitosan dicampur 1,33 ml aquabidestilata lalu divortex. d. Larutan nano kitosan 500 ppm : 0,3 mlnano kitosan dicampur 1,7 ml aquabidestilata lalu divortex. e. Larutan nano kitosan 250 ppm : 0,167 ml nano kitosan dicampur 1,833 ml aquabidestilata lalu divortex. 4. Pembiakan C. albicans C.albicans dibiakan pada media Sabouroud Dekstrosa Agar dengan cara di strick menggunakan ose steril. Tujuan nya adalah untuk peremajaan C. albicans. Inkubasi lagi di dalam incubator selama 24 jam dengan suhu 35 o C. Persiapan suspensi C. albicans yang telah diremajakan, terlebih dahulu distandarisasi dengan menggunakan 1 Mc Farland. Ambil satu sengkelit jamur dan masukkan ke dalam tabung berisi NaCl, kemudian ukur tingkat kekeruhannya dengan alat pengukur colony counter hingga menunjukkan angka 1. Bandingkan juga tingkat kekeruhannya dengan 1 Mc Farland sampai menunjukkan tingkat kekeruhan yang sama. Bila kekeruhannya kurang dari standar maka dapat ditambahkan C. albicans, bila kekeruhannya melebihi 24

7 standar maka ditambahkan NaCl. Tingkat kekeruhan Candida yang sama dengan kekeruhan standar menunjukkan kerapatan Candida sama dengan standar Mc. Farland 10 8 CFU/ml. C. albicans sudah siap digunakan dalam penelitian. 5. Pengujian Antijamur dengan Metode Difusi Pembuatan nano kitosan dengan konsentrasi 3000 ppm, 2000 ppm, 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm. Sediakan 5 tabung, untuk tabung pertama masukkan 2 ml nano kitosan 3000ppm nano 100%. Kemudian pembuatan nano kitosan konsentrasi 2000 ppm, ambil 1,33 ml larutan nano kitosan 3000 ppm pada tabung ke dua dan masukkan aqua bidestilata sebanyak 0,67 ml, kemudian untuk konsentrasi 1000 ppm campurkan 0,67 ml larutan nano kitosan dengan 1,33 ml aqua bidestilata pada tabung ke tiga. Konsentrasi 500 ppm dengan mencampurkan 0,3 ml larutan nano kitosan dengan 1,7 ml aqua bidestilata pada tabung ke empat, dan untuk konsentrasi 250 ppm campurkan 0,167 ml larutan nano kitosan dengan 1,833 ml aqua bidestilata pada tabung ke lima. Lalu homogenkan masing-masing konsentrasi sampai rata menggunakan mesin vortex. Tahap pertama pada uji aktivitas antijamur ini adalah dengan menaruh paper disk pada setiap tabung steril kosong masing-masing 1 paper disk, lalu teteskan larutan nano kitosan dengan konsentrasi yang berbeda pada setiap paper disc sebanyak 20 μl sehingga didapat konsentrasi larutan nano kitosan per paper disc dengan menggunakan pipet mikro. Untuk kontrol (+) paper disc diteteskan antijamur nistatin dan kontrol (-) paper disc diteteskan asam asetat 1 N sebanyak 20 μl. Paper disc yang telah berisi larutan nano kitosan dibiarkan sampai menyerap atau pelarutnya menguap dalam cawan steril ± 10 menit. Tahap selanjutnya, menggoreskan suspensi C.albicans pada media Sabouroud Dekstrosa Agar dengan metode swab. Cara Metode swab, dengan memasukan catton bud pada suspensi jamur, lalu digoreskan secara merata diatas permukaan media SDA padat menggunakan catton bud. Setelah itu masing-masing paper disc diletakkan 25

8 dipermukaan cawan petri berisi agar dan jamur dengan menggunakan pinset steril. Sedikit menekan supaya paper disk benar-benar menempel pada agar. Dalam satu cawan ditempelkan tiga paper disc dengan konsentrasi berbeda. Cawan tersebut kemudian diinkubasi dalam keadaan terbalik dalam waktu 1x 24 jam dengan suhu 37 o C. Penelitian ini dilakukan tiga kali perlakuan dengan metode yang sama (triplo). Aktivitas antijamur dapat dilihat dengan mengamati zona hambat yang terbentuk di sekeliling paper disc. Antijamur dikatakan positif jika terbentuk zona hambatan berupa zona bening di sekeliling paper disc dan antijamur negatif ditandai dengan tidak terbentuknya zona bening. Diameter zona hambat yang terbentuk diukur lebarnya menggunakan penggaris atau jangka sorong. Besar diameter zona hambat dihitung dengan cara mengurangi diameter zona hambat yang terbentuk pada cawan petri uji dengan diameter paper disc. 6. Pengamatan Pengamatan dilakukan setelah jam, lalu lakukan perhitungan diameter pada zona pada setiap konsentrasi dengan menggunakan jangka sorong. 7. Analisis Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan metode analisis yaitu Uji normalitas, Uji Kruskal-Wallis, dan Uji Mann-Whitney 26