BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Tuberkulosis (TB) adalah penyakit menular yang disebabkan oleh infeksi Mycobacterium tuberculosis. Bakteri ini pada umumnya menyerang paru-paru (pulmonary tuberculosis), selain paru-paru bakteri ini juga dapat menyerang bagian organ lain di dalam tubuh (extrapulmonary tuberculosis). TB dapat menyebar di udara saat orang yang terjangkit mengalami batuk, sehingga droplet akan mudah terbawa oleh udara (WHO, 2015). WHO (2015) melaporkan bahwa lima negara yang memiliki jumlah terbesar kasus TB pada tahun 2014 adalah India, Indonesia, Cina, Nigeria dan Afrika Selatan. India, Indonesia dan Cina menyumbang total 43% dalam kasus global pada tahun 2014. Diperkirakan pada tahun 2014 Indonesia mengalami peningkatan jumlah kasus TB dibandingkan dengan perkiraan sebelumnya, yaitu sekitar 1 juta kasus baru setiap tahunnya. Tuberkulosis dapat disembuhkan dengan melakukan pemberian obat antituberkulosis (OAT) yang tepat. Namun saat ini ditemukan adanya galur M. tuberculosis yang resisten terhadap beberapa jenis OAT, galur ini disebut galur Multi Drug Resistant TB (MDR-TB). MDR-TB adalah resistensi yang terjadi terhadap dua jenis OAT lini pertama yang efektif yaitu isoniazid dan rifampisin (WHO, 2015). WHO memperkirakan pada tahun 2013, di Indonesia terdapat kasus MDR-TB sebanyak 6.800 kasus baru setiap tahun. Diperkirakan 2% terjadi dari kasus TB baru dan 12% dari kasus TB dengan pengobatan ulang, selain itu 1
2 lebih dari 55% pasien dengan MDR-TB belum terdiagnosis ataupun mendapat pengobatan yang tepat (Kementrian Kesehatan RI, 2015). Angka kematian akibat tuberkulosis yang akan berkembang menjadi MDR-TB diperkirakan sejumlah 480.000 kasus, sehingga menjadi masalah serius yang penting untuk ditangani (WHO, 2014). Rifampisin merupakan OAT lini pertama yang bersifat bakterisidal terhadap M. tuberculosis (Katzung, 2006). Karakteristik penting dari rifampisin yaitu dapat melawan secara aktif pertumbuhan basil M. tuberculosis dan memperlambat metabolisme basil (Silva dan Palomina, 2011). Mekanisme rifampisin adalah menghambat sintesis RNA M. tuberculosis dengan cara mengikat sub unit β RNA polimerase. Jika terjadi perubahan asam amino penyusun protein yang mengkode sub unit β RNA polimerase, maka akan mengakibatkan terjadinya perubahan konformasi ikatan obat rifampisin yang dapat mempengaruhi afinitasnya. Hal ini akan menyebabkan proses transkripsi masih dapat berlangsung karena kerja rifampisin menjadi tidak optimal, sehingga M. tuberculosis menjadi resisten (Katzung, 2006; Silva dan Palomina, 2011). Dilaporkan dari beberapa penelitian yang dilakukan mengenai resistensi rifampisin, bahwa 90% penderita TB yang resisten terhadap rifampisin juga resisten terhadap isoniazid. Berdasarkan alasan ini, maka resistensi rifampisin merupakan surrogate marker untuk MDR-TB (Lewis et al., 2002; Syaifudin dkk., 2007; Silva dan Palomina, 2011). Penelitian lain menyatakan bahwa 96,1% mutasi yang terjadi pada rifampisin ditemukan di daerah Rifampicin Resistance Determining Region (RRDR), yaitu pada fragmen 81 pb yang mencakup kodon
3 507-533 pada gen rpob (Ramaswamy dan Musser, 1998). Sun et al (2009) melaporkan bahwa mutasi pada daerah RRDR terjadi perubahan asam amino pada kodon H526D/Y/R/L, S531L, D516V dan L533P. Frekuensi mutasi yang sering terjadi pada RRDR telah dilaporkan sebanyak 46,1% pada kodon 526 dan 38,2 % pada kodon 531, sedangkan sisanya 6,9 % pada kodon 516 dan 2,9 % pada kodon 533 (Sun et al., 2009). Pada studi tersebut disimpulkan bahwa keempat kodon tersebut merupakan titik mutasi mayor yang sering terjadi pada daerah RRDR gen rpob M. tuberculosis untuk resistensi rifampisin. Penelitian yang dilakukan oleh Titov et al (2006) di Belarus juga melaporkan bahwa frekuensi mutasi yang terjadi pada kodon 526 sebanyak 45,4%, pada kodon 531 sebanyak 29% dan kodon 516 sebanyak 9,1 %. Penelitian ini membandingkan penelitian yang dilakukan oleh Hirano et al (1999), khususnya untuk mutasi yang sering terjadi pada kodon 516 dari isolat beberapa negara di Asia. Penelitian ini menyatakan bahwa telah ditemukan mutasi dengan frekuensi tertinggi untuk kodon 516 yaitu sebanyak 14,4% dan merupakan mutasi tertinggi pada kodon 516 untuk beberapa negara di Asia (Hirano et al., 1999). Penelitian lain yang dilakukan oleh Yasmin et al (2014), Valim et al (2000) dan Khosravi et al (2012) beberapa mutasi yang sering terjadi pada daerah RRDR juga ditemukan pada kodon L511P, S512A/T, Q513P, F514V, M515I, Q517P, L521P, S522L, L524W dan T525P. Selain itu pada penelitian yang dilakukan oleh Mani et al (2001), mutasi di daerah RRDR juga ditemukan pada kodon N518H dan pada penelitian Wang et al (2013) juga ditemukannya mutasi baru, yaitu mutasi delesi pada kodon 519. Penelitian terbaru yang dilakukan di Bali, dari 6
4 isolat diketahui terjadi perubahan asam amino pada kodon Q510R, D516Y, H526L dan S531L, (Pradnyaniti, 2013; Rusyanthini, 2013, Wijaya, 2013). Dalam mengatasi resistensi yang terjadi pada kasus MDR-TB, maka diperlukan metode deteksi yang cepat untuk memberikan terapi yang tepat bagi pasien sesegera mungkin, untuk mendeteksi terjadinya mutasi pada daerah RRDR gen rpob M. tuberculosis. Sebelumnya metode yang sering digunakan untuk melakukan deteksi yaitu metode PCR konvensional. Namun metode PCR konvensional tidak sepenuhnya efisien, maka dari itu diperlukan adanya pengembangan variasi metode PCR untuk meningkatkan efisiensi deteksi, salah satunya yaitu metode real-time PCR (Turner et al., 2005). Menurut penelitiaan yang dilakukan oleh Siregar et al (2012) mengenai pengembangan real-time PCR, perbandingan metode real-time PCR dengan metode PCR konvensional berdasarkan hasil analisis memiliki tingkat kepercayaan 95% dan sensitivitas antara PCR real-time dengan metode konvensional tidak berbeda secara signifikan. Walaupun demikian, tidak seperti metode PCR konvensional lainnya, metode PCR real-time memiliki keunggulan dapat mendeteksi patogen secara kualitatif maupun kuantitatif, sedangkan metode PCR konvensional hanya memiliki kemampuan mendeteksi patogen secara kualitatif saja (Ramirez et al., 2010; Siregar et al., 2012). Metode real-time PCR menggunakan beberapa komponen seperti halnya PCR konvensional, salah satu komponen yang membantu proses deteksi yaitu DNA probe. DNA probe adalah agen pendeteksi dalam real-time PCR, berupa molekul asam nukleat yang memiliki afinitas kuat dan dapat berikatan spesifik dengan
5 target DNA atau RNA sekuens (Walker dan Rapley, 2005). Salah satu probe yang biasanya sering digunakan pada metode real-time PCR yaitu TaqMan probe. TaqMan probe adalah jenis probe hidrolisis, probe ini merupakan oligonukleotida standar yang dapat berikatan secara kovalen dengan reporter pada ujung 5 dan quencher pada ujung 3. TaqMan probe dirancang spesifik untuk mengikat DNA target dengan reporter pewarna fluoresen di salah satu ujung dan quencher sebagai pemadam fluoresen pada ujung yang lainnya (Dorak, 2007). Keunggulan dari TaqMan probe yaitu desain dan sintesisnya lebih mudah dibandingkan jenis probe lainnya (Navaro et al., 2015). Pemilihan probe merupakan langkah awal untuk memperoleh probe terbaik yang digunakan untuk metode real-time PCR, yakni menggunakan metode in silico dengan bantuan perangkat lunak komputer yang akan menghasilkan beberapa desain DNA probe (Ram et al., 2008). Pada penelitian ini difokuskan untuk mendesain atau merancang sebuah DNA probe wild-type sensitif yang nantinya akan menghasilkan beberapa pilihan DNA probe, sehingga memudahkan untuk memilih DNA probe berdasarkan kriteria probe terbaik secara umum. Hasil rancangan DNA probe akan diseleksi untuk mendapatkan DNA probe terbaik berdasarkan pustaka yang sesuai dengan kriteria pelabelan TaqMan probe. TaqMan probe yang terpilih akan digunakan untuk metode real-time PCR dan diharapkan dapat membantu proses deteksi adanya mutasi di daerah RRDR pada kasus resistensi gen rpob M. tuberculosis. Keuntungan dari desain DNA probe menggunakan metode in silico, yaitu lebih ekonomis dan cepat (Zhang et al., 2007). Metode in silico dapat digunakan untuk mengetahui struktur sekunder dan polimofisme nukleotida tunggal pada situs
6 penempelan primer maupun probe (D haene et al., 2010). Hal ini akan memudahkan peneliti untuk mengetahui lebih dini bahwa DNA probe yang didesain telah memenuhi kriteria probe terbaik dan dapat mendeteksi adanya mutasi pada daerah RRDR gen rpob M. tuberculosis dengan tepat menggunakan metode real-time PCR. Daerah mutasi yang dipilih dalam melakukan perancangan DNA probe pada penelitian ini adalah daerah RRDR gen rpob M. tuberculosis yang mencakup kodon 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518 dan 519. Pemilihan kodon pada daerah RRDR gen rpob M. tuberculosis sebagai target perancangan DNA probe berdasarkan ditemukannya mutasi dan merupakan kodon yang memiliki frekuensi mutasi yang sering terjadi serta berkaitan dengan beberapa kasus resistensi rifampisin (Valim et al., 2000; Sun et al., 2009; Yasmin et al., 2014). Perancangan DNA probe dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Clone Manager Suite 6 yang memberikan variasi rancangan DNA probe. Hasil rancangan akan dianalis berdasarkan kriteria probe terbaik secara umum yang meliputi, panjang nukleotida DNA probe optimum 18-30 basa dengan kandungan GC sebesar 40-60%, nilai T m ºC probe harus lebih besar dibandingkan dengan nilai T m ºC primer, tidak terdapat daerah yang komplemen terhadap probe yang menyebabkan terbentuknya struktur hairpin dan struktur dimer, runs dan repeats disarankan kurang dari 4 basa (Walker dan Rapley, 2005; McPherson dan Moller, 2006). DNA Probe terbaik yang diperoleh pada analisis tahap awal akan dianalisis kembali berdasarkan kesesuaian DNA probe tersebut dengan kriteria pelabelan TaqMan probe untuk metode real-time PCR, yang meliputi posisi basa G yang
7 disarankan berada pada urutan basa ke-3 dari ujung 5 dan jumlah basa C harus lebih banyak dibandingkan dengan basa G (McPherson dan Moller, 2006; Rychlik, 2010) 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan di atas, maka dapat disusun beberapa rumusan masalah sebagai berikut: 1.2.1 Bagaimanakah urutan DNA probe yang dapat digunakan untuk mendeteksi adanya mutasi yang terjadi pada daerah RRDR gen rpob M. tuberculosis? 1.2.2 Bagaimanakah kesesuaian hasil rancangan DNA probe terbaik berdasarkan kriteria TaqMan probe untuk metode real-time PCR? 1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Untuk mendapatkan urutan DNA probe yang dapat digunakan untuk mendeteksi adanya mutasi yang terjadi pada daerah RRDR gen rpob M. tuberculosis. 1.3.2 Untuk mengetahui kesesuaian hasil rancangan DNA probe terbaik berdasarkan kriteria TaqMan probe untuk metode real-time PCR. 1.4 Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai rancangan DNA probe terbaik yang digunakan untuk mendeteksi adanya mutasi pada daerah RRDR gen rpob M. tuberculosis, yang nantinya dapat membantu proses diagnosis lebih cepat dan efektif, sehingga dapat menentukan strategi terapi yang lebih
8 tepat. Selain itu hasil DNA probe terbaik yang dirancang dapat digunakan sebagai data refrensi DNA probe untuk metode real-time PCR.