METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini telah dilaksanakan di Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi Nutrisi, dan Laboratorium Nutrisi Ternak Perah, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Waktu penelitian dilaksanakan dari bulan September 2008 sampai Maret 2009. Materi Bahan Bahan pakan sumber serat yang digunakan yaitu rumput gajah, jerami padi dan serat sawit yang sudah digiling halus. Sumber inokulum yaitu isolat bakteri simbion rayap yang berasal dari rayap Coptotermes curvignathus Holmgren yaitu isolat A (SB 53 5(3)1) dan rayap Microtermes inspiratus Kemner yaitu isolat D (SC 51 5 (2)). Cairan rumen yang digunakan sebagai bahan adalah cairan rumen sapi yang diotoklaf, dengan tujuan cairan rumen otoklaf dapat dimanfaatkan sebagai makanan bagi isolat bakteri rayap. Bahan kimia yang digunakan yaitu larutan McDougall, gas CO 2, larutan pepsin HCl 0,2 %, larutan asam borat, larutan HgCl 2, larutan Na 2 CO 3 jenuh, larutan H 2 SO 4 0,005 N, vaselin, larutan H 2 SO 4 15 %, larutan NaOH 0,5 N, larutan HCl 0,5 N, indikator phenolphtalein (PP), dan aquades. Alat Peralatan yang digunakan adalah tabung fermentor, shaker waterbath, cawan Conway, cawan porselin, sentrifuse, pompa vakum, Buret, labu Erlenmeyer, tabung Hungate, inkubator, kertas saring Whatman No. 41, seperangkat alat destilasi, otoklaf, probe karet, pipet, tanur 600 o C, dan oven 105 o C. Rancangan Perlakuan Perlakuan bakteri yang dilakukan dalam penelitian ini terdiri atas 3 faktor dengan 3 ulangan. Adapun ketiga faktor tersebut adalah: Faktor A : isolat bakteri rayap, yaitu A1= isolat bakteri rayap Coptotermes curvignathus Holmgren (isolat A (SB 53 5(3)1) dan A2= isolat bakteri rayap Microtermes inspiratus Kemner (isolat D (SC 51 5 (2)). 18
Faktor B : taraf inokulum isolat bakteri, yaitu B1= 10 6 CFU/ml, B2= 10 8 CFU/ml, B3 = 10 10 CFU/ml. Faktor C : jenis pakan sumber serat, yaitu C1= rumput gajah (RG), C2= jerami padi (JP) dan C3= serat sawit (SS). Peubah yang diamati Peubah-peubah yang diamati dalam penelitian in vitro ini adalah: 1. Konsentrasi VFA total (mm) Konsentrasi VFA total dianalisis dengan menggunakan teknik destilasi uap (General Laboratory Procedures, 1966). 2. Konsentrasi NH 3 (Amonia) (mm) Konsentrasi ammonia dianalisis dengan menggunakan metode mikrodifusi Conway (General Laboratory Procedures, 1966). 3. KCBK (Koefisien Cerna Bahan Kering) dan KCBO (Koefisien Cerna Bahan Organik) (%) KCBK dan KCBO diukur dengan menggunakan metode Tilley and Terry (1963) 4. Populasi bakteri total yang dihitung dengan metode pengenceran berseri yang dijelaskan oleh Ogimoto and Imai (1981). Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak kelompok dengan pola faktorial 2 3 3 dengan 3 periode pengambilan cairan rumen sebagai kelompok. Faktor A adalah isolat bakteri rayap, yaitu A1= isolat bakteri rayap Coptotermes curvignathus Holmgren (isolat A (SB 53 5(3)1) dan A2= isolat bakteri rayap Microtermes inspiratus Kemner (isolat D (SC 51 5 (2)). Faktor B adalah taraf inokulum isolat bakteri, yaitu B1= 10 6 CFU/ml, B2= 10 8 CFU/ml, B3 = 10 10 CFU/ml. Faktor C adalah jenis pakan sumber serat, yaitu C1= rumput gajah (RG), C2= jerami padi (JP) dan C3= serat sawit (SS). Adapun model matematik yang digunakan dalam penelitian adalah : Yijkl Keterangan : = µ+αi +β j+γ k +αiβ j+αiγ k +β jγk +αiβ jγ k +δl ijkl Y : Nilai pengamatan isolat bakteri rayap ke-i, taraf inokulum ke-j, pakan sumber serat ke-k, dan blok ke -l + ε ijkl 19
µ : Nilai rataan umum α i : Efek utama isolat bakteri rayap ke-i, i = 1 dan 2 β j : Efek utama taraf inokulum ke-j, j = 1, 2 dan 3 γ k : Efek utama bahan pakan sumber serat ke-k, k = 1, 2 dan 3 α i β j α iγ k β j γ k : Efek interaksi antara isolat bakteri rayap ke-i dan taraf inokulum ke-j : Efek interaksi antara isolat bakteri rayap ke-i dan bahan pakan sumber serat ke-k : Efek interaksi antara taraf inokulum ke-j faktor II dan bahan pakan sumber serat ke-k α iβ jγ k : Efek interaksi antara isolat bakteri rayap ke-i, taraf inokulum ke-j dan bahan pakan sumber serat ke-k δ l : Efek blok ke-l, l = 1, 2 dan 3 ε ijkl : Error (galat) dari isolat bakteri rayap ke-i, taraf inokulum ke-j, pakan sumber serat ke-k, dan blok ke -l Data yang diperoleh dianalisis menggunakan sidik ragam (ANOVA), jika terdapat pengaruh yang nyata terhadap peubah yang diamati, perbedaan antar perlakuan diuji dengan ortogonal kontras dan polinomial (Steel dan Torrie, 1993). Populasi bakteri total dianalisis secara deskriptif. Peremajaan Bakteri Prosedur Media basal (BHI) sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan dialiri gas, kemudian tabung ditutup dengan probe karet dan diselotip agar keadaan media tumbuh bakteri tetap dalam kondisi anaerob. Kemudian sumber inokulum bakteri dimasukkan ke dalam tabung tersebut. Tabung lalu dimasukkan ke dalam inkubator (suhu 39 o C) selama 24 jam. Mikroba ini selanjutnya digunakan sebagai inokulum pada uji fermentasi dan kecernaan in vitro. Pencernaan Fermentatif (Anaerob) Bahan pakan ditimbang sebanyak satu gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung fermentor yang telah diberi label. Larutan McDougall diturunkan ph-nya hingga 6,5-6,8, kemudian sebanyak 12 ml dimasukkan ke dalam tabung fermentor tersebut disertai dengan penambahan gas CO 2. Cairan rumen yang telah diotoklaf 20
dimasukkan ke dalam tabung tersebut sebanyak 6 ml, kemudian sumber inokulum dimasukkan sebanyak 2 ml. Larutan dialiri gas CO 2 selama 30 detik, kemudian tabung ditutup dengan probe karet yang berventilasi. Setelah dialiri gas CO 2, tabung fermentor dimasukkan ke dalam shaker waterbath dengan suhu 39 o C dan difermentasi selama 6 jam. Setelah 6 jam, tutup karet dibuka kemudian ditambahkan 0,2 ml larutan HgCl 2 jenuh untuk mematikan mikroba. Cairan dalam tabung fermentor diambil dengan menggunakan pipet dan dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse. Tabung sentrifuse tersebut disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit dan supernatannya ditampung dalam tabung film untuk analisa konsentrasi VFA dan NH 3. Pengukuran Konsentrasi NH 3 Pengukuran ini dilakukan dengan metode mikrodifusi Conway. Supernatan dari pencernaan fermentatif diambil sebanyak 1 ml dan ditempatkan pada salah satu ujung alur cawan, sedangkan Na 2 CO 3 jenuh ditempatkan pada ujung alur cawan sebelahnya (kedua bahan tersebut tidak boleh bercampur sebelum tutup cawan ditutup rapat). Larutan asam borat berindikator sebanyak 1 ml ditempatkan dalam cawan kecil yang terletak di tengah cawan Conway. Selanjutnya cawan Conway yang sebelumnya telah diolesi vaselin pada bibir dan tutupnya ditutup rapat agar tidak ada NH 3 yang keluar. Larutan Na 2 CO 3 jenuh dicampurkan dengan supernatan sampel hingga merata dengan cara menggoyang-goyangkan dan memiringkannya. Sebelum titrasi, cawan Conway dibiarkan selama 24 jam pada suhu kamar. Setelah 24 jam, tutup cawan dibuka dan asam borat dititrasi dengan H 2 SO 4 0,005 N sampai warnanya berubah dari biru menjadi kemerah-merahan. Saat titrasi, asam borat tidak boleh terkontaminasi oleh supernatan karena warna asam borat tidak akan berubah menjadi merah. Konsentrasi NH 3 dihitung dengan rumus : Konsentrasi NH 3 (mm) = ml H2SO4 x N H2SO4 x 1000 berat sampel x BK sampel Pengukuran Konsentrasi VFA Konsentrasi VFA diukur dengan menggunakan teknik destilasi uap (steam destilation). Sebanyak 5 ml supernatan (berasal dari tabung yang sama dengan supernatan untuk analisa NH 3 ) dimasukkan ke dalam tabung destilasi, lalu 21
ditambahkan 1 ml H 2 SO 4 15 %. Dinding tabung dibilas dengan aquades dan secepatnya ditutup dengan sumbat karet yang telah dihubungkan dengan pipa destilasi berdiameter ± 0,5 cm. Kemudian ujung pipa yang lain dihubungkan dengan alat pendingin Leibig. Tabung destilasi dimasukkan ke dalam labu didih yang telah berisi air mendidih tanpa menyentuh permukaan air tersebut. Uap air panas akan mendesak VFA dan akan terkondensasi di dalam pendingin. Hasil destilasi ditampung dengan labu Erlenmeyer 300 ml yang telah diisi 5 ml NaOH 0,5 N. Proses destilasi selesai pada saat jumlah destilat yang tertampung mencapai ± 250 ml. Destilat yang tertampung ditambah indikator phenolphthalein (PP) sebanyak 2-3 tetes, lalu dititrasi dengan HCl 0,5 N sampai terjadi perubahan dari warna merah jambu menjadi tidak berwarna (bening). Konsentrasi VFA total diukur dengan rumus : Keterangan : a = volume titran blanko b = volume titran sampel a - b x N HCl x 1000 / 5 ml VFA Total (mm) = ( ) berat sampel x BK sampel Perhitungan Populasi Bakteri Total Populasi bakteri dihitung dengan metode pencacah koloni bakteri hidup. Hal pertama yang harus dilakukan adalah membuat media tumbuh yaitu dengan cara: bahan-bahan media dicampur, kemudian dimasukkan ke dalam botol yang telah diotoklaf, kemudian diukur phnya sekitar ph 6,8. Media pembiakan yang digunakan adalah non selektif media untuk total bakteri. Kemudian media dimasukkan ke dalam tabung Hungate masing-masing sebanyak 4,9 ml yang sebelumnya telah diisi agar bacto sebanyak 0,150 g. Media lalu disterilkan dalam otoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit dengan tekanan 1,2 Kg/cm 3. Setelah siap digunakan untuk pembiakan bakteri, media agar dimasukkan ke dalam penangas air pada suhu 47 C. Contoh cairan yang akan dikulturkan diencerkan terlebih dahulu, dengan media pengenceran. Pengenceran dilakukan sebagai berikut: 0,05 ml kultur bakteri dimasukkan ke dalam 4,95 ml media pengencer. Selanjutnya dari media pengencer diambil kembali sebanyak 0,05 ml, lalu dimasukkan ke dalam 4,95 ml media pengencer berikutnya. Perlakuan tersebut dilakukan sampai tabung ke-5. Kemudian 22
dari masing-masing seri tabung pengenceran diambil sebanyak 0,1 ml, kemudian dimasukkan ke media agar dan diputar sambil dialiri air pada roller tube, agar media dapat menjadi padat secara merata. Selanjutnya bakteri diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator. Perhitungan jumlah bakteri dilakukan dengan cara sebagai berikut : Populasi bakteri = Keterangan : x : tabung seri pengenceran ke-x Jumlah koloni x 0,05 x 10 0,1 Pencernaan Hidrolisis (Aerob) Produk fermentasi yang telah dipisahkan supernatannya pada percobaan fermentabilitas (24 jam), ditambah larutan enzim pepsin HCl 0,2 % (20 ml), kemudian dilakukan proses inkubasi lanjutan secara aerob sampai 24 jam dalam shaker waterbath. Setelah 24 jam campuran tersebut disaring dengan kertas saring Whatman No. 41 menggunakan pompa vakum untuk mendapatkan residunya. Koefisien Cerna Bahan Kering (KCBK) Residu yang telah dipisahkan dari supernatannya, kemudian dimasukkan ke dalam cawan porselin untuk diuapkan airnya di dalam oven 105 o C selama 24 jam. Dari penguapan dengan oven 105 o C tersebut didapatkan bahan kering. Bobot kering sampel dalam cawan porselin kemudian ditimbang. Selanjutnya, untuk menentukan besaran koefisien kecernaan bahan kering dapat dihitung menggunakan cara berikut ini : BKasal (BK residu BK blanko ) Persentase KCBK = 100% BKasal Adapun bahan kering blanko diperoleh dari penguapan residu asal fermentasi tanpa bahan pakan dengan oven 105 o C, sedangkan bahan kering asal diperoleh dari penguapan oven 105 o C pada bahan pakan percobaan yang mendapat perlakuan yang sama, tetapi tidak difermentasikan (tidak ditambahkan inokulum). Koefisien Cerna Bahan Organik (KCBO) Besaran koefisien cerna bahan organik pakan diperoleh dari perhitungan bobot abu residu. Untuk mengetahui bobot abu residu, sampel dalam cawan porselin 23
yang telah diuapkan pada analisa KCBK, kemudian dimasukkan ke dalam tanur suhu 600 o C selama 6 jam. Setelah 6 jam, cawan porselin tersebut diangkat dan ditimbang bobot abunya setelah terlebih dahulu didinginkan di dalam eksikator. Bobot bahan organik diperoleh dengan mengurangi bobot kering dengan bobot abu residu. Besaran koefisien cerna bahan organik dihitung dengan cara berikut ini : BO Persentase KCBO = asal (BOresidu BOblanko) 100% BOasal Penentuan bahan organik blanko (BO blanko) diperoleh dari pengabuan residu asal fermentasi tanpa bahan pakan dengan tanur 600 o C. Sedangkan bahan organik asal (BO asal) diperoleh dari pengabuan dengan tanur 600 o C pada bahan pakan percobaan yang mendapat perlakuan yang sama, tetapi tidak difermentasikan (tidak ditambahkan inokulum). 24