MATERI DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Ilmu Nutrisi Ternak Perah dan Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi Nutrisi, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Institut Pertanian Bogor.Penelitian ini dilakukan selama satu bulan terhitung mulai Februari 2012 sampai Maret 2012. Materi Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat-alat analisa in vitro seperti timbangan digital, tabung fermentor, shaker waterbath, tabung gas CO 2, oven 105 0 C, tanur listrik 600 0 C, cawan porselen, alat-alat destilasi, kertas saring Whatman no.41, cawan Conway, erlenmeyer, alat-alat titrasi, ph meter, spoit, botol film, mikroskop, counting chamber dan cover glass. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain ransum komplit. Ransum terdiri dari rumput gajah, bungkil kedelai giling, onggok giling, dedakd dan jagung, serta supelemen berupa vitamin E, unsur Se (Na 2 SeO 3 ), crude palm oil (CPO)dan minyak jagung. Bahan lain yang digunakan adalah kemasan, label, larutan McDougall dengan komposisi (Na 2 CO 3, Na 2 HPO 4.2H 2 O, KCl, NaCl, MgSO 4.7H 2 O, CaCl 2 dan aquadest), larutan buffer rumen dan larutan TBFS (tryphan blue formalinesalin). Metode Perlakuan Perlakuan yang digunakan adalah berupa perlakuan ransum.perlakuan meliputi penambahan vitamin E sebanyak 100ppm pakan, Se (Na 2 SeO 3 ) sebesar 0,5 ppm, CPOatau minyak jagung sebanyak 2 gram. Penggunaan CPO sebagai sumber asam lemak jenuh adalah sebagai pembanding terhadap penggunaan minyak jagung sebagai sumber asam lemak tidak jenuh.perlakuan tersebut adalah: P0 = ransum basal P1 = P0 + vitamin E +CPO P2 = P0 + vitamin E + minyakjagung P3 = P0 + selenium + CPO P4 = P0 + selenium + minyakjagung
Peubah yang diamati Peubah yang diamati pada penelitian ini adalah: 1. Pengukuran VFA totaldengan steam destilation methode(department of Diary Science, 1966) 2. Pengukuran NH 3 total dengan conway micro difussion methode(department of Diary Science, 1966). 3. Koefisien cerna bahan kering (KCBK) dan koefisien cerna bahan organik (KCBO) metode Tilley and Terry (1963) 4. Penghitungan populasi protozoa dengan metode pewarnaan Persiapan Sampel Prosedur Kerja Sampel diambil dari ransum komplit baik ransum basal maupun ransum perlakuan. Ransum komplit disusun dengan komponen bahan pakan yang sama kecuali komponen minyak. Formulasi ransum komplit yang digunakanserta kandungan nutriennya berdasarkan perhitunganditunjukkan dalam Tabel 1. Tabel 2. Formulasi Ransum Komplit yang Digunakan Sebagai Kontrol dalam Penelitian Komposisi (%) Bahan Pakan Rumput Gajah 35 Onggok 5 Dedak 15 Jagung 25 Bungkil Kedelai 20 Total 100 Kadar Nutrien BK 87,57 Abu 9,55 Lemak 1,55 SK 14,59 BETN 57,46 16
Pakan perlakuan disupelementasi dengan minyak. Minyak yang digunakan adalah CPO sebagai sumber asam lemak jenuh dan minyak jagung sebagai sumber asam lemak tidak jenuh. Ransum komplit perlakuan disupelementasi dengan vitamin E atau Se (Na 2 SeO 3 ). Semua bahan pakan dicampur secara manual. Sampel dari pakan yang telah dibuat diambil segera dan digunakan untuk analisis fermentasi in vitro dengan peubah yang diukur adalah kecernaan, kadar VFA, NH 3 dan populasi total protozoa dalam filtrat. Analisis Karakteristik Fermentasi Kajian karakteristik fermentasi rumen dilakukan melalui proses fermentasi menggunakan cairan rumen segar. Sebanyak 0,5 g sampel dari masing-masing perlakuan dimasukkan ke dalam tabung fermentor kemudian ditambahkan 40 ml larutan McDougall dan dimasukkan ke dalam shaker waterbath dengan suhu 39 o C. Setelah itu cairan rumen dimasukkan sebanyak 10 ml, tabung dikocok dengan dialiri gas CO 2 selama 30 detik. Keasaman larutan dikontrol agar berada pada ph (6,5-6,9) dan kemudian ditutup dengan tutup karet berventilasi. Fermentasi dilakukan selama 4 jam. Setelah 4 jam, tutup karet tabung fermentor dibuka, ditambahkan 2-3 tetes HgCl 2 untuk membunuh mikroba. Tabung fermentor disentrifugasi pada kecepatan 4.000rpm selama 10 menit. Substrat terpisah menjadi endapan di bagian bawah dan supernatan yang bening berada di bagian atas. Supernatan diambil untuk keperluan analisanh 3 dan VFA. Supernatan dimasukkan ke dalam botol film, apabila tidak dilakukan analisis segera, sampel disimpan dilemari pendingin (freezer). Pengukuran KCBK dan KCBO Tabung fermentor yang telah diisi dengan 0,5 g sampel dari masing-masing perlakuan, ditambahkan ke dalamnya 40 ml larutan McDougall. Tabung dimasukkan ke dalam shaker waterbath dengan suhu 39 o C, kemudian diisi cairan rumen 10 ml, tabung dikocok dengan dialiri CO 2 selama 30 detik. Keasaman media dipertahankan pada ph 6,5-6,9. Kemudian ditutup dengan karet berventilasi, dan difermentasi selama 48 jam. Setelah 48 jam, tutup karet tabung fermentor dibuka dan diteteskan 2-3 tetes HgCl 2 untuk membunuh mikroba. Tabung fermentor disentrifugasi pada kecepatan 4.000rpm selama 10 menit. Substrat terpisah menjadi endapan di bagian bawah dan supernatan yang bening berada di bagian atas.supernatan dibuang dan 17
endapan hasil sentrifusa ditambah 50ml larutan pepsin-hcl 0,2%. Campuran tersebut lalu diinkubasi kembali selama 48 jam tanpa tutup karet. Sisa pencernaan disaring dengan kertas Whatman no. 41 (yang sudah diketahui bobotnya) dengan bantuan pompa vakum. Endapan yang ada di kertas saring dimasukkan ke dalam cawan porselen, setelah itu dimasukkan ke dalam oven 105⁰C selama 24 jam. Setelah 24 jam, cawan porselen + kertas saring + residu dikeluarkan, dimasukkan ke dalam eksikator dan ditimbang untuk mengetahui persentase bahan keringnya. Selanjutnya bahan dalam cawan diabukan dalam tanur listrik selama 6 jam pada suhu 450-600 o C, kemudian setelah didinginkan dalam eksikator ditimbang untuk mengetahui persentase bahan organiknya. Sebagai blanko dipakai residu asal fermentasi tanpa sampel. Perhitungan kecernaan bahan kering (KCBK) dan bahan organik (KCBO) dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut: BK sampel (g) {BK residu (g) BK blanko (g)} KCBK (%) = BKsampel x 100% KCBO (%) = BOsampel (g) {BOresidu (g) BOblanko (g)} BOsampel x 100% Pengukuran Konsentrasi NH 3 Amonia dalam filtrat diukur dengan metoda mikro difusi Conway (Department of Diary Science, 1966).Bibir cawan Conway dan tutupnya diolesi dengan vaselin, supernatan yang berasal dari proses fermentasi diambil 1 ml kemudian ditempatkan pada salah satu ujung alur cawan Conway. Larutan Na 2 CO 3 jenuh sebanyak 1 ml ditempatkan pada salah satu ujung cawan Conway bersebelahan dengan supernatan. Larutan asam borat berindikator sebanyak 1 ml di tempatkan di dalam cawan kecil yang terletak di tengah cawan Conway. Cawan Conway yang sudah diolesi vaselin ditutup rapat hingga kedap udara, larutan Na 2 CO 3 dicampur dengan supernatan hingga merata dengan cara menggoyang goyangkan dan memiringkan cawan tersebut. Setelah itu dibiarkan selama 24 jam dalam suhu kamar. Setelah 24 jam suhu kamar, dibuka dan asam borat berindikator dititrasi dengan H 2 SO 4 0,005 N sampai terjadi perubahan warna dari biru menjadi merah. Perhitungan kadar NH 3 filtrat dihitung dengan rumus berikut: 18
mm NH 3 = ml H 2 SO 4 x N H 2 SO 4 x 1000 g sampel x BK sampel Pengukuran Konsentrasi VFA Kadar VFA (Volatile Fatty Acids) diukur dengan metoda destilasi uap (Department of Diary Science, 1966). Presscookersumber uap diisi dengan aquades sampai tanda MAX. Kemudian air pendingin dari kran dipastikan mengalir agar berfungsi dengan baik. Kompor gas selanjutnya dinyalakan, sehingga aquades yang ada dalam presscooker tersebut mendidih dan menghasilkan uap yang masuk ke tabung-tabung destilasi, hal ini menandakan bahwa analisis VFA bisa dimulai. Supernatan yang sama dengan analisa NH 3 diambil sebanyak 5ml, kemudian dimasukkan ke dalam tabung destilasi. Erlenmeyer yang berisi 5 ml NaOH 0,5 N ditempatkan di bawah selang tampungan. Larutan H 2 SO 4 15% sebanyak 1 ml ditambahkan ke tabung destilasi yang telah diisi larutan sampel, kemudian segera ditutup, dan dibilas dengan aquadest. Uap air panas mendesak VFA dan terkondensasi dalam pendingin. Air yang terbentuk ditampung labu erlenmeyer yang berisi 5 ml NaOH 0,5 N sampai mencapai 300 ml. Indikator PP (Phenolpthalein) ditambahkan sebanyak 2-3 tetes dan dititrasi dengan HCl 0,5 N sampai warna titran berubah dari merah menjadi merah muda seulas. Larutan HCl 0,5 N sebagai titrat distandardisasi terlebih dahulu sehingga didapat konsentrasi dengan empat digit di belakang koma. Kadar VFA total dalam filtrat dihitung dengan rumus: (a-b) x N HCl x 1000 VFA total(mm) = 5 Keterangan: a = volume titran blanko; b = volume titran contoh. Pengukuran Populasi Protozoa Pengukuran populasi protozoa dilakukan dengan menggunakan metode pewarnaan dengan larutan tryphan blue formaline salin (TBFS) seperti yang dilakukan dalam penelitian Sunaryadi (1999). Larutan TBFS terbuat dari 100 ml formaldehid 35%, 2 g triphan blue, 9 g NaCl, dan 900 ml aquades. Sebanyak 1 ml larutan TBFS dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dicampur dengan 1 ml cairan rumen segar kemudian diaduk merata sambil dialiri gas CO 2. Cairan tersebut diteteskan ke dalam counting chamber dan ditutup dengan cover glass sampai rata. 19
Counting chamber yang digunakan mempunyai ketebalan 0,1 mm, dengan luas kotak terkecil 0,0625 mm yang terdapat 16 kotak dan kotak yang dibaca sebanyak 5 kotak. Populasi protozoa diamati dengan mikroskop lensa obyektif sebanyak 5 kotak, dengan pembesaran 400 kali.populasi protozoa dihitung dengan persamaan berikut: 1000 x FP x C Populasi protozoa total = 0,0625 x 0,1 x 16 x 5 Keterangan:C = jumlah protozoa terhitung dalam counting chamber (sisi kanan atas,kiri atas,kanan bawah,kiri bawah dan tengah);fp = faktor pengenceran (jumlah perbandingan yaitu 2);0,1 = ketebalan counting chamber;0,0625 = luas kotak terkecil (mm 2 ); 16 = jumlah kotak dalam counting chamber;5 = jumlah kotak yang dibaca. Analisis Data Percobaan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) lima perlakuan dengan tiga ulangan. Analisis data dilakukan terhadap kecernaan, VFA, NH 3 dan populasi protozoa total.model matematik yang digunakan adalah sebagai berikut (Mattjik dan Sumertajaya, 2006) : Y ij = µ + τ i + ε ij atau Y ij = µ i + ε ij Keterangan: i = 1, 2,..., t; j = 1, 2,..., r; Y ij = Nilai pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j; μ = Nilai rataan umum; τi = Pengaruh perlakuan ke-i, = μ i - μ; εij = Pengaruh acak perlakuan ke-i dan ulangan ke-j. Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA),jika terdapat perbedaan yang nyata, maka dilakukan uji kontras lanjut Duncan. 20