1 BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental di laboratorium untuk memperoleh data.data yang dikumpulkan adalah data primer. Pengumpulan data dilakukan secara langsung oleh peneliti. Pengolahan data dilakukan dengan analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa eugenol dalam ekstrak etanol rimpang lengkuas. Subyek dalam penelitian ini adalah ekstrak etanol rimpang lengkuas, sedangkan obyek dalam penelitian ini adalah kadar senyawa eugenol yang terkandung dalam ekstrak etanol rimpang lengkuas tersebut. Tahap awal penelitian dimulai dengan ekstraksi lengkuas, kemudian dilanjutkan tahap kedua yaitu analisis kualitatif senyawa eugenol dalam sampel menggunakan kromatografi lapis tipis. Tahap selanjutnya adalah pembuatan kurva baku dan analisis kuantitatif menggunakan densitometer, yang keduanya didukung dengan literatur dan pustaka yang sesuai dengan judul, kemudian dianalisis kadar eugenol total dan hubungannya dengan konsentrasi pelarut yang optimum. 3.2 Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalahtimbangan gram (Denver INST.TL603D), neraca analitik (Mettler Toledo AT400),blender (Philip), ayakan nomor 60 mesh, gelas beaker 600 ml (Pyrex), batang pengaduk, seperangkat alat rotary evaporator (Bibby RE 200B), cawan porselin, waterbath (Memmert), kertas saring (Whattman No.42), corong kaca (Pyrex), labu ukur 5 16
2 ml dan 10 ml (Pyrex),gelas ukur10 ml dan 100 ml (Pyrex), pipet ukur 1 ml (Pyrex), glass firm (Pipette), flakon, chamber (CAMAG),mikropipet (Gilson), platsilika gel 60 F 254 (Merck Kieselgel), lampu UV 254 dan UV 366, serta seperangkat alat densitometer (CAMAG TLCScanner). Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah simplisia rimpang lengkuas yang diperoleh dari Pasar Mojosongo Surakarta, akuades (redestilasi), etanol teknis (Brataco Chemika), n-heksan pro analysis (Brataco Chemika), etil asetat pro analisis(brataco Chemika), etanol pro analysis (Brataco Chemika) dan standar eugenol (Merck). 3.3 Preparasi Bahan Uji Sampel yang digunakan berupa rimpang lengkuas segar yang diperoleh dari Pasar Mojosongo, Surakarta. Rimpang lengkuas selanjutnya dicuci bersih, diiris tipis dan dikeringkan pada suhu 25 Cuntuk mengurangi kadar air dalam lengkuas yang dapat mengganggu proses analisis. Simplisia rimpang lengkuas yang diperoleh selanjutnya dihaluskan dengan blender dan diayak dengan ayakan nomor 60 meshuntuk meningkatkan luas permukaan kontak antara simplisia dengan pelarut (Mahae dan Chaiseri, 2009).Pelarut yang digunakan berupa etanol yang dibuat menjadi 5 seri konsentrasi, yaitu 0%; 30%; 50%; 70%; dan 96% dengan akuades sebagai larutan pengencer. 3.4 Waktu dan Tempat Pelaksanaan Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Farmasetika FMIPA UNS untuk ekstraksi, Laboratorium Pusat FMIPA UNS Sublab Kimia untuk analisis
3 kualitatif kromatografi lapis tipis sertasublab Biologiuntuk analisis kuantitatif densitometri yang dilaksanakan pada bulan Januari Mei 2016. 3.5 Identifikasi Variabel Penelitian a. Variabel Bebas : Seri konsentrasi etanol sebagai pelarut pada ekstraksirimpanglengkuas. b. Variabel Tergantung : Kadar senyawa eugenol dalam ekstrak etanol rimpang lengkuas. c. Variabel Terkendali : Metode ekstraksidan metode analisis senyawa eugenol dalam ekstrak etanol rimpang lengkuas. 3.6Prosedur Kerja a. Pembuatan Seri Konsentrasi Pelarut Pelarut yang digunakan adalah etanol dalam beberapa seri konsentrasi, yaitu 0%; 30%; 50%; 70% dan 96%. Masing-masing seri dibuat sebanyak 500 ml. Pembuatan seri konsentrasi pelarut dilakukandengan pengenceran etanol 96%menggunakan rumus perhitungan berikut: M 1 x V 1 = M 2 x V 2 M 1 adalah konsentrasi etanol yang diinginkan, M 2 adalah konsentrasi etanol murni (96%), V 1 adalah volume etanol yang diinginkan (500 ml), dan V 2 adalah volume etanol murni yang dibutuhkan untuk pengenceran. b. Ekstraksi Menurut Mahae dan Chaiseri (2009), ekstraksi lengkuas secara maserasi kinetik, yaitu maserasi dengan pemanasan 50 C disertai pengadukan secara
4 continue selama satu jammenggunakan etanoldengan perbandingan simplisia dan pelarut 1:10. Untuk pelarut sebanyak 500 ml, maka simplisia lengkuas yang diperlukan adalah sebanyak 50 gram.ekstrak cair yang diperoleh kemudian dipisahkan dari ampas residu dengan kertas saring, kemudiandikentalkan dengan rotary evaporator pada suhu 40 C. ekstrak kental yang diperoleh disimpan dalam refrigerator, diwadahi flakon kaca yang dilapisi alumunium foil. c. Analisis Eugenol Prosedur analisis kadar eugenol dalam sampel secara KLT Densitometri menurut Kinasih (2013) adalah sebagai berikut: 1. Analisis Kualitatif Eugenol standar dan sampel ditotolkan sebanyak 2 µl pada plat silika gel 60 F 254, lalu dielusi pada fase gerak yang telah jenuh sampai batas jarak rambat 8 cm, kemudian plat diangkat dan dikeringkan pada suhu kamar. Visualisasi bercak pada plat dilihat dengan sinar UV 254 nm, kemudian dilakukan perhitungan nilai Rf pada bercak yang sejajar antara eugenol standar dan sampel. 2. Analisis Kuantitatif a) Pembuatan Larutan Stok Eugenol Standar Pembuatan larutan stok eugenol standar 20000 ppm dilakukan dengan mengambil larutan standar eugenol sebanyak 0,1 gram kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml dan dilarutkan dengan etanol pro analysishingga tanda dan gojog agar homogen. Setelah itu
5 membuat larutan stok 2000 ppm dengan mengambil 2 ml dari larutan stok 20000 ppm dan dilarutkan 20 ml etanol pro analysisdan digojog hingga homogen. b) Pembuatan Larutan Baku Eugenol Konsentrasi kurva baku untuk eugenol adalah 950, 1000, 1050, 1150, 1200 dan 1250 ppm. Pembuatan dengan larutan stok eugenol 2000 ppm diambil sebanyak 0,95; 1; 1,05; 1,2; dan 1,25 ml kemudian masing-masing dilarutkan dengan etanol pro analysis sampai volume 2 ml dan digojog sampai homogen. c) Penentuan λ Maks Eugenol Larutan baku eugenol kadar 950 ppm ditotolkan sebanyak 2 µl pada plat KLT dengan fase diam silika gel 60 F 254 dan dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah jenuh dengan fase gerak. Plat silika hasil pengembangan dikeluarkan dari bejana lalu dikeringkan. Plat hasil pengembangan discanning pada rentang panjang gelombang pengamatan 250-400 nm menggunakan lampu deuterium pada TLC scanner. d) Penentuan Kurva Baku Eugenol Seri Larutan baku masing-masing ditotolkan sebanyak 2 µl pada plat KLT dengan fase diam silika gel 60 F 254 dan dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah jenuh dengan fase gerak dengan jarak pengembangan 10 cm. Plat silika hasil pengembangan dikeluarkan dari bejana lalu dikeringkan. Plat silika hasil pengembangan diukur
6 Area Under Curve (AUC) dan tinggi puncaknya dengan alat TLC scanner pada panjang gelombang 283 nm. Selanjutnya dihitung persamaan kurva baku, nilai standar deviasi relatif, dan nilai koefisien korelasinya, kemudian diplotkan dalam grafik kadar vs AUC. e) Penetapan Kadar Eugenol dalam Sampel Kadar eugenol dalam ekstrak etanol rimpang lengkuas ditentukan menggunakan persamaan regeresi linear yang diperoleh dari kurva baku. Persamaan regresi linear yang diperoleh kemudian dihubungkan dengan AUC sehingga dapat dihitung kadar eugenol dalam sampel. 3.7Analisis Data Analisis data dilakukan dengan pendekatan secara teoritis.analisis kualitatif menggunakan kromatografi lapis tipis terhadap rimpang lengkuas menjadi titik awal yang menunjukan adanya senyawa eugenol dalam ekstrak etanol rimpang lengkuas. Identifikasieugenol pada sampel dilakukan dengan teknik visualisasi noda sampel dan standar, serta dengan membandingkan nilai Rf antarasampel dan standar. Menurut Ditjen BPOM (1988), hasil dinilai positif jika nilai Rfsampel sama atau mendekati Rf baku dengan selisih 0,2.Analisis data secara kualitatif juga dapat dilakukan dengan melihat kesamaan spektra densitometri antara standar dengan sampel, sedangkan analisis kuantitatif kadar eugenol dilakukan dengan TLC scanner terhadap hasil kromatografi lapis tipis sehingga diperoleh nilai Rf serta kadar analit dengan menggunakan persamaan regresi linear.
7 Kadar yang diperoleh dari tiap sampel dapat digunakan untuk menentukankonsentrasi etanol yang optimum untuk dapat mengekstrak senyawa eugenol dengan kadar total tertinggi. Analisis kuantitatif eugenol dengan menggunakan metode kurva kalibrasi, yaitu dengan membuat kurva hubungan antara konsentrasi dengan absorbansi.
8