MATERI DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli 2011 sampai April 2012 bertempat di Indira Farm Hamtaro and Rabbit House, Istana Kelinci, dan di Unit Rehabilitasi Reproduksi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Materi Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian adalah vagina buatan, mikroskop cahaya, gelas objek dan penutup, water bath, heating table, ph paper, pipet, mikropipet, pipet Pasteur, counting chamber, tabung Eppendorf, stopwatch, counter, termometer, termos, spoit, aluminium foil, dan bak pencuci. Bahan yang digunakan antara lain semen kelinci yang berasal dari 3 ekor kelinci Lop dan 3 ekor kelinci Rex (berbobot badan 2-2.5 kg dalam usia produktif), 1 ekor kelinci Lop betina, 1 ekor kelinci Rex betina, alkohol, NaCl 0.9%, KY Jelly, larutan Hipoosmotik (Natrium Sitrat dan Fruktosa), bahan pewarnaan Eosin Nigrosin, dan bahan pewarnaan Williams (alkohol absolut, chloramin 0.5%, air destilasi, alkohol 95%, dan larutan Williams). Metode Penelitian Persiapan Kelinci Kelinci jantan dipelihara dalam kandang individual, dipelihara juga kelinci betina sebagai pemancing (teaser) di kandang lain. Persiapan Vagina Buatan dan Koleksi Semen Komponen vagina buatan, yaitu outer layer, inner linner, termometer, tabung penampung, KY Jelly, spoit, dan karet disiapkan (Gambar 4). Inner linner dimasukkan ke dalam outer layer dan diikat pada kedua ujungnya menggunakan karet. Melalui lubang kecil pada outer layer, air hangat bersuhu 40 o C dimasukkan dengan menggunakan spoit hingga inner linner mengembang. KY jelly lalu dioleskan pada sepertiga bagian depan vagina buatan. Tabung penampung kemudian dipasangkan pada bagian belakang vagina buatan, sedangkan bagian depan dibiarkan terbuka sebagai tempat penis intromisi (Gambar 4).
11 Daerah sekitar preputium kelinci dibersihkan dengan menggunakan NaCl 0.9%. Teaser kemudian dimasukkan ke dalam kandang pejantan atau didekatkan dengan pejantan. Pejantan dibiarkan menaiki pemancing (mounting). Pada saat yang bersamaan, vagina buatan diarahkan pada penis kelinci. Koleksi semen dilakukan sebanyak 3 kali dengan interval waktu 3 hari. Gambar 4 Komponen vagina buatan (kiri) dan vagina buatan (kanan). Evaluasi Semen Evaluasi semen yang dilakukan meliputi evaluasi secara makroskopis dan mikroskopis. Secara makroskopis, volume semen, ph, konsistensi, serta warna semen dapat dinilai. Sedangkan secara mikroskopis, gerakan massa, motilitas, skor individu, konsentrasi, viabilitas, dan morfologi spermatozoa dapat dinilai. Evaluasi Makroskopis: 1. Warna dapat dinilai langsung dengan menggunakan indra penglihatan, akan diperoleh warna putih, krem, atau kuning. 2. Volume dapat dilihat langsung dari skala yang ditunjukkan pada tabung penampung. 3. Konsistensi didapatkan dengan menggoyangkan tabung berisi semen, akan diperoleh hasil encer, sedang, atau kental.
12 4. ph dapat diketahui dengan membaca hasil pada ph paper yang dicelupkan pada semen. Evaluasi Mikroskopis: 1. Gerakan massa Gerakan massa dapat dinilai dengan mengamati pergerakan spermatozoa menyerupai gelombang pada mikroskop perbesaran 100X, yaitu dengan meneteskan satu tetes semen ke atas permukaan gelas objek dan selanjutnya dilihat di bawah mikroskop. Pemeriksaan dilakukan minimal pada lima lapang pandang berbeda. Hasil yang diperoleh adalah (+++), (++), (+), atau (-). 2. Skor individu dan Motilitas Skor individu dan motilitas dapat dinilai dengan bentuan cairan isotonis NaCl 0.9%. Satu tetes semen dicampurkan dengan empat tetes NaCl 0.9% dan ditutup gelas penutup, lalu diamati di mikroskop perbesaran 400X. Skor individu spermatozoa dinilai berdasarkan kecepatan pergerakan spermatozoa (1-5), sedangkan motilitas dinilai berdasarkan banyaknya spermatozoa yang bergerak progressive dan dinyatakan dalam persen (%). Pemeriksaan dilakukan minimal pada lima lapang pandang berbeda. 3. Viabilitas Viabilitas dinilai menggunakan bantuan pewarnaan Eosin Nigrosin. Satu tetes spermatozoa dicampur dengan empat tetes pewarna Eosin Nigrosin lalu diulas, difiksasi di atas meja pemanas, dan diamati di bawah mikroskop perbesaran 400X. Sebanyak sepuluh lapang pandang spermatozoa dihitung. Spermatozoa hidup akan memiliki kepala berwarna putih, sedangkan spermatozoa mati akan memiliki kepala berwarna merah. Gambar 5 Proses pewarnaan eosin nigrosin.
13 4. Konsentrasi Spermatozoa Sebanyak 5 µl semen dicampurkan dengan 95 µl formol salin. Kemudian campuran tersebut diteteskan pada counting chamber. Konsentrasi spermatozoa adalah jumlah spermatozoa dalam counting chamber x 10 6 dengan satuan spermatozoa per ml. Gambar 6 Kamar hitung Neubauer dan bidang hitungnya. Pemeriksaan Morfologi Spermatozoa Morfologi spermatozoa diwarnai dengan pewarnaan Williams. Dari sampel semen segar yang ada, dibuat preparat ulas dan difiksasi di atas meja pemanas. Preparat ulas yang telah siap kemudian dicuci dalam alkohol absolut selama 4 menit dan dikeringudarakan. Selanjutnya preparat dicelupkan berulang kali dalam larutan chloramin 0.5% selama 1-2 menit atau hingga lendir (mucous) hilang dan ulasan terlihat jernih. Preparat kemudian dicuci dalam air destilasi. Setelah itu preparat dicelupkan dalam alkohol 95%. Selama 8-10 menit selanjutmya, preparat diwarnai dengan larutan Williams. Langkah terakhir, preparat dicuci dengan air mengalir hingga ulasan terlihat jernih dan dikeringkan. Sebanyak sepuluh lapang pandang diperiksa dari preparat yang telah diwarnai. Pemeriksaan dilakukan dengan mikroskop cahaya perbesaran 400X.
14 Pengujian Keutuhan Membran Plasma Spermatozoa Pengujian dilakukan menggunakan larutan campuran 0.735 g Natrium Sitrat dan 1.351 g Fruktosa dalam 100 ml aquadest dan diatur tekanannya menjadi 50 mosm/kg (TO 50 ), 100 mosm/kg (TO 100 ), dan 150 mosm/kg (TO 150 ). Sebanyak 10 µl semen dari masing-masing kelinci dicampur dengan 2 ml larutan sesuai perlakuan. Campuran kemudian diinkubasi dalam water bath (37 o C) dan diamati setiap 15 menit selama 1 jam. Pemeriksaan dilakukan dengan perbesaran 400X pada sepuluh lapang pandang. Spermatozoa dengan membran plasma utuh akan memperlihatkan kebengkokan ekor (coil). Analisis Data Data dianalisis secara statistik menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA) dilanjutkan dengan Uji Duncan untuk melihat perbedaan antar breed. Data yang diperoleh dari HOS test dianalisis menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan pola tiga faktor, yaitu faktor breed, tekanan osmotik, dan waktu. Seluruh data dianalisis menggunakan komputer dengan program SAS 9.1.3. Data disajikan dalam bentuk rataan ± standar deviasi.