12 3 METODOLOGI PENELITIAN Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Maret sampai dengan bulan November 2012 di Instalasi Penelitian Plasma Nutfah Perikanan Air Tawar, Cijeruk, Bogor. Analisis hormon testosteron dan estradiol dilakukan di Laboratorium Hormon Unit Rehabilitasi dan Reproduksi, Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Materi Uji dan Rancangan Penelitian Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah induk ikan mas dengan bobot ± 1.5 kg per ekor (betina) dan ± 0.5 kg per ekor (jantan), berasal dari Instalasi Penelitian Plasma Nutfah Perikanan Air Tawar Cijeruk Bogor (Gambar 6A). Induk ikan tawes (jantan dan betina) dengan bobot sekitar 0.5 kg per ekor, berasal dari petani ikan di Desa Petir Kecamatan Darmaga Bogor (Gambar 6B). (A) (B) Gambar 6 Induk ikan mas (A) dan induk ikan tawes (B) Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan satu faktor dalam RAL dengan 5 perlakuan dan 3 kali ulangan (Tabel 1 dan Lampiran 1). Tabel 1 Perlakuan A B C D E Desain perlakuan pemijahan ikan mas dalam merangsang pemijahan ikan tawes dalam metode Cangkringan Keterangan Ikan Mas ( tidak disuntik) dan ikan tawes ( ) Ikan Mas ( disuntik) dan ikan tawes ( ) Ikan Mas ( tidak disuntik, disuntik) dan ikan tawes ( ) Ikan Mas ( disuntik) dan ikan tawes ( ) Ikan Mas ( tidak disuntik) dan ikan tawes ( ) Metode Penelitian Persiapan Induk Induk telah siap digunakan sebagai organisme uji ketika telah matang gonad. Kematangan gonad pada ikan mas betina ditandai dengan perut yang membesar, gerakan lamban, lubang genital agak terbuka dan memerah. Pada ikan
tawes betina, kematangan gonad ditandai dengan perut yang membuncit pula ke arah anus dan bila diraba terasa lunak. Tanda lain adalah terlihatnya pembuluh darah pada sirip dada, sirip perut dan sirip ekor lebih jelas daripada biasanya dan berwarna kemerah-merahan. Kematangan induk jantan ditunjukkan oleh keluarnya cairan putih dengan mudah jika perutnya diurut dari bagian perut ke arah anus. Persiapan wadah Wadah yang digunakan berupa bak fiber berbentuk bulat dengan volume 2.25 ton sebanyak 15 unit yang masing-masing di dalamnya ditempatkan hapa sebagai pemisah antara ikan mas dan ikan tawes (Gambar 7). Kakaban ditempatkan dalam bak untuk tempat penempelan telur ikan mas. Air dialirkan ke bak pemijahan hingga tinggi air kira-kira 75 cm setelah pemasangan hapa selesai kemudian diaerasi. Temperatur berkisar antara 25 27 o C. Pada setiap wadah ditempatkan kamera perekam dengan jarak 50 cm dari atas permukaan air untuk pengamatan tingkah laku ikan sebelum, selama dan setelah pemijahan. 13 Gambar 7 Wadah perlakuan yang digunakan selama penelitian; hapa sebagai pemisah antara ikan mas dan ikan tawes (panah) Pemberokan Induk Induk-induk ikan diberok terlebih dahulu sebelum dipijahkan, yaitu dengan memelihara induk jantan dan induk betina secara terpisah untuk menghindari pemijahan liar. Pemberokan juga bertujuan untuk membuang sisa pakan dan mengurangi lemak pada daerah ovarium induk betina sehingga tidak mengganggu kelancaran pelepasan telur. Pemberokan ikan mas dilakukan selama 2 hari dan ikan tawes selama 5 hari. Pengambilan Contoh Telur Pengambilan contoh telur dilakukan setelah pemberokan untuk keperluan pengukuran diameter dan melihat posisi inti telur. Pengambilan contoh telur
14 dilakukan dengan metode kanulasi pada semua induk ikan mas dan ikan tawes (Gambar 8A). Contoh telur diambil minimal sebanyak 30 butir per ekor (Taufek et al. 2009). Pengamatan posisi inti telur dilakukan dengan meneteskan secara merata larutan serra (alkohol 99% : formaldehida 40% : asam asetat 100% dengan perbandingan 6 : 3 : 1) pada sampel telur (Yueh dan Chang 2000; Zarski et al. 2011), kemudian diamati di bawah mikroskop. Diameter telur diukur dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 40x yang dilengkapi dengan mikrometer okuler. Pengambilan Contoh Darah Contoh darah diambil untuk keperluan analisis hormon testosteron dan estradiol. Pengambilan contoh darah dilakukan hanya pada induk ikan mas, sebanyak dua kali, yaitu sebelum penyuntikan pertama dan setelah pemijahan. Ikan dianestesi terlebih dahulu sebelum pengambilan contoh darah dengan cara direndam ke dalam larutan 2-fenoksi etanol (0.3 ml L -1 air media). Ikan kemudian di beri tanda dan contoh darahnya diambil sebanyak 1.5 ml dari vena ekor (MUAWC 2008) dengan menggunakan spuit 23G (UNZEN) yang telah diisi larutan antikoagulan (Natrium citrat hydrat 3.8%) 0.1 ml (Gambar 8B), kemudian disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4 o C. Supernatan berupa plasma diambil kemudian dimasukkan ke dalam tabung polietilen dan disimpan pada suhu -20 o C sampai saat analisis hormon dilakukan. Ikan uji kemudian dimasukkan ke dalam bak fiber untuk pemulihan selama 2 jam sebelum penyuntikan dilakukan. Penyuntikan Induk Induk ditimbang terlebih dahulu sebelum penyuntikan dilakukan untuk menentukan banyaknya hormon yang disuntikkan. Induk disuntik dengan ovaprim pada dosis 0.6 ml kg -1 bobot tubuh secara intramuskular (Gambar 8C) untuk merangsang ovulasi. Penyuntikan hanya dilakukan pada ikan mas. Penyuntikan dilakukan sebanyak 2 kali untuk ikan betina (dosis 30 : 70) dengan interval penyuntikan masing-masing selama 6 jam dan 1 kali untuk ikan jantan. Pada perlakuan K(-) atau perlakuan A tidak dilakukan penyuntikan. (A) (B) (C) Gambar 8 Pengambilan telur dengan metode kanulasi (A); pengambilan sampel darah dari vena ekor (B); penyuntikan induk dilakukan secara intramuscular (C) Pemijahan dengan sistem imbas Sesaat setelah penyuntikan, induk-induk ikan kemudian dimasukkan kedalam wadah penelitian. Padat penebaran pada masing-masing bak adalah
3 ekor ikan mas (jenis kelamin sesuai perlakuan) dan 2 ekor ikan tawes (1 jantan + 1 betina). Setelah penyuntikan kedua pada ikan mas, dilakukan pengamatan terhadap respon ikan tawes selama 12 jam. Jika induk-induk ikan tawes belum mijah, maka pengamatan dilanjutkan sampai 36 jam kemudian, dengan interval pemeriksaan setiap 3 jam. Parameter Penelitian Tingkat Kematangan Gonad Tingkat kematangan gonad pada induk ikan mas dan ikan tawes dapat dilihat dari diameter dan posisi inti telurnya. Telur yang telah matang memiliki ukuran diameter maksimum dan inti telur yang tampak jelas, lebih kecil dan berada di tengah (fase dorman) atau sudah mulai bergerak ke tepi (germinal vesicle migration, GVM) (Rottmann et al. 1991; Yueh dan Chang 2000). Tingkah Laku Reproduksi Ikan Tingkah laku reproduksi ikan dapat dibagi menjadi tiga yaitu tingkah laku pada fase prapemijahan, pemijahan dan pasca pemijahan. Pengamatan dilakukan pada ikan mas dan ikan tawes pada ketiga fase tersebut. Diameter Telur Pengukuran diameter telur dipengaruhi oleh perbesaran lensa objektif. Penghitungan pengukuran diameter telur menggunakan rumus : A = B/C x 0.01 mm A = ukuran sebenarnya dalam mm, B = nilai yang diperoleh dari pengamatan mikrometer, C = pembesaran lensa dibagi 100. Waktu Induk Mencapai Ovulasi Setelah penyuntikan kedua, dilakukan pencatatan terhadap lama waktu masing-masing ikan memijah. Waktu ikan mas mencapai ovulasi (WOM) dihitung sebagai waktu yang diperlukan ikan mas dari mulai penyuntikan kedua hingga mijah. Waktu ikan tawes mencapai ovulasi (WOT) dihitung sebagai waktu yang diperlukan ikan tawes mulai dari ikan mas mijah hingga ikan tawes mijah. Derajat Pemijahan (DP) Ikan Tawes Persentase induk yang berovulasi ditentukan dari jumlah induk yang mengalami ovulasi pada setiap perlakuan dibagi dengan total induk pada perlakuan tersebut dan dinyatakan dalam persen, yaitu dapat dihitung dihitung dengan menggunakan rumus : Jumlah induk yang mengalami ovulasi DP = x 100 % Jumlah seluruh induk Jumlah Telur yang Diovulasikan (TO) pada Ikan Tawes Jumlah telur yang diovulasikan dapat dihitung dengan menggunakan rumus : TO = (Bg/Bs) x N 15
16 TO = jumlah telur yang diovulasikan, Bg = bobot gonad (g), Bs = bobot sub sampel gonad (g), N = jumlah telur dalam sub sampel gonad (butir). Derajat Pembuahan (Fertilization Rate, FR) Telur Ikan Tawes Derajat pembuahan telur merupakan persentase telur yang dibuahi dari sejumlah telur yang dipijahkan. Telur yang dibuahi akan tampak berwarna bening transparan, sedangkan telur yang tidak dibuahi akan berwarna putih keruh. Derajat pembuahan telur dapat dihitung dengan rumus : Jumlah telur yang dibuahi FR = x 100 % Jumlah Telur yang dipijahkan Derajat Penetasan (Hatching Rate, HR) Ikan Tawes Derajat penetasan pada ikan tawes ditentukan dari jumlah telur yang menetas dibagi dengan total telur yang dibuahi dan dinyatakan dalam persen. Derajat penetasan dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : Jumlah telur yang menetas HR = x 100 % Jumlah Telur yang dibuahi Konsentrasi Hormon Testosteron dan Estradiol Ikan Mas Hormon testosteron dan estradiol dianalisis dengan Enzyme Linked Immuno Absorbent Assay (ELISA). Parameter Kualitas Air Pada penelitian ini dilakukan pengamatan terhadap beberapa parameter kualitas air sebagai data penunjang seperti suhu, DO dan ph. Analisis Data Data dianalisis secara deskriptif dan ditampilkan dalam bentuk tabel dan gambar. 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Tingkat Kematangan Gonad Induk-induk ikan yang siap dipijahkan telah matang gonad. Hal ini dapat dilihat secara visual dengan mengamati ukuran diameter telur dan posisi intinya. Berdasarkan hasil pengamatan diameter dan posisi inti (germinal vesicle) telur pada penelitian ini, tampak bahwa induk-induk ikan yang digunakan baik ikan mas maupun ikan tawes telah matang gonad. Kematangan telur tersebut juga dapat dilihat dari penampilan telur yang bulat dan seragam ukurannya.