3. METODOLOGI 3.1 Pelaksanaan Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Laboratorium Biokiomia Hasil Perairan, Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan II, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Terpadu, Fakultas Kedokteran Hewan, dan Laboratorium Penelitian I, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Dokumentasi penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1. 3.2 Bahan dan Alat Penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan utama ikan bandeng dengan ukuran 200-250 g/ekor. Ikan bandeng yang digunakan diberi empat perlakuan, yaitu ikan bandeng yang tidak dipuasakan sebelum dipanen dan disimpan pada suhu ruang (kode: P), ikan bandeng yang dipuasakan sebelum dipanen dan disimpan pada suhu ruang (kode: Q), ikan bandeng yang tidak dipuasakan sebelum dipanen dan disimpan pada suhu chilling (kode: R) dan ikan bandeng yang dipuasakan sebelum dipanen pada penyimpanan suhu chilling (kode: S). Bahan-bahan untuk analisis nilai ph (larutan buffer standar ph 4 dan 7, akuades), analisis total volatile base (TVB) (H 3 BO 3, K 2 CO 3, TCA 7 %, HCl 0,032 N), analisis total plate count (TPC) (larutan garam 0,85 % steril, nutrient agar), ekstraksi enzim katepsin (buffer tris-hcl ph 7,4), assay aktivitas katepsin (akuades, hemoglobin, HCl 1 N, TCA 5 %, pereaksi folin, tirosin), pembuatan kolagen (kulit ikan bandeng dan asam asetat), ekstraksi enzim kolagenase (buffer tris-hcl (ph 8,0) yang mengandung 0,25 % Triton-X 100 dan 10 mm CaCl 2 ), assay aktivitas kolagen (buffer tris-hcl ph 7,5 yang mengandung 5 mm CaCl 2, TCA 5 %, ninhydrin, 50 % 1-propanol), pengukuran konsentrasi protein (akuades, bovine serum albumin, coomassie brilliant blue G-250, etanol 95 %, asam fosfat 85 % (b/v)). Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain pisau, talenan, alat bedah, ph meter, cawan conway, inkubator, oven, sentrifuse suhu dingin,
20 spektrofotometer, mikropipet, timbangan analitik, homogenizer, magnetic stirer, hot plate, pipet volumetrik, bulb, pipet tetes, tabung reaksi, cawan petri, erlenmeyer, kapas, tissue, aluminium foil, bunsen, jarum ose, beaker glass, dan peralatan gelas lainnya serta peralatan uji organoleptik. 3.3 Tahapan Penelitian Penelitian dilakukan dalam dua tahap, meliputi penelitian pendahuluan untuk menentukan fase post mortem ikan secara organoleptik. Penelitian utama meliputi tiga tahap, yaitu tahap pertama adalah mempelajari pola kemunduran mutu serta perubahan parameter kesegaran kulit ikan yang terjadi, tahap kedua adalah ekstraksi enzim katepsin dan kolagenase serta mengetahui aktivitasnya. Tahap ketiga adalah pengukuran konsentrasi protein katepsin dan kolagenase. Kerangka penelitian secara keseluruhan dapat dilihat pada Lampiran 2. 3.3.1 Penelitian pendahuluan Penelitian pendahuluan bertujuan untuk mengetahui waktu terjadinya fase post mortem ikan, meliputi pre rigor, rigor mortis, post rigor dan busuk. Pada tahap ini dilakukan penyimpanan pada suhu ruang (26-30 0 C) dan suhu chilling ((-1)-5 0 C). Penyimpanan pada suhu ruang dilakukan selama 19 jam dengan interval waktu pengamatan satu jam, sedangkan pada suhu chilling penyimpanan dilakukan selama 540 jam (23 hari) dengan interval waktu pengamatan 12 jam. Pengamatan dilakukan secara organoleptik menggunakan score sheet berdasarkan SNI 01-2346-2006 (Lampiran 3). 3.3.2 Penelitian utama Penelitian utama bertujuan untuk mengetahui pola kemunduran ikan P, Q, R, dan S berdasarkan analisis tingkat kesegaran ikan pada setiap tahap post mortem. Pada tahap ini dilakukan pengamatan terhadap sampel ikan berdasarkan waktu yang didapat dari hasil penentuan fase post mortem pada penelitian tahap pendahuluan. Analisis yang dilakukan pada setiap pengamatan meliputi uji organoleptik menggunakan score sheet berdasarkan SNI 01-2346-2006 (BSN b 2006), uji nilai ph, TVB dan TPC, assay aktivitas katepsin dan kolagenase, serta konsentrasi protein katepsin dan kolagenase.
21 3.4 Analisis Sampel kulit ikan bandeng pada setiap tahap post mortem diambil dan dilakukan pengamatan serta analisis, meliputi pengamatan dan analisis tingkat kesegaran ikan (penilaian organoleptik, penentuan nilai ph, TVB, penghitungan jumlah total bakteri dengan menggunakan metode TPC), serta ekstraksi enzim katepsin dan kolagenase untuk assay aktivitas katepsin dan kolagenase. 3.4.1 Uji organoleptik (BSN b 2006) Metode yang digunakan untuk uji organoleptik adalah dengan score sheet berdasarkan SNI 01-2346-2006 (BSN b 2006). Pengujian organoleptik merupakan cara pengujian yang bersifat subyektif menggunakan indera yang ditujukan pada mata, insang, lendir permukaan, badan, daging, bau, dan tekstur. Pada uji organoleptik ini, ada beberapa syarat yang harus disepakati oleh panelis (BSN b 2006) antara lain: tertarik dan mau, terampil dan konsisten dalam mengambil keputusan, siap sedia pada saat dibutuhkan dalam pengujian, tidak menolak contoh yang akan diuji, berbadan sehat, bebas dari penyakit THT dan tidak buta warna, serta jumlah panelis minimum untuk satu kali pengujian adalah 15 orang (semi-terlatih). Dari data yang diperoleh, kemudian dilakukan analisis kesegaran ikan dengan kriteria sebagai berikut (SNI 01-2346-2006): Segar : nilai organoleptik berkisar antara 7-9 Agak segar : nilai organoleptik berkisar antara 5-6 Tidak segar : nilai organoleptik berkisar antara 1-3 3.4.2 Uji nilai ph (Apriyantono et al. 1989) Pengukuran ph dilakukan dengan menggunakan ph meter dengan cara dikalibrasi terlebih dahulu. Sampel sebanyak 10 gram yang diambil dari bagian kulit ikan dihomogenkan dengan homogenizer dengan 90 ml air destilata. Kemudian ph homogen diukur dengan ph meter yang sebelumnya telah dikalibrasi dengan buffer standar ph 4 dan 7. 3.4.3 Uji total volatile base (TVB) (Apriyantono et al. 1989) Penetapan ini bertujuan untuk menentukan jumlah kandungan senyawa-senyawa basa volatil yang terbentuk akibat degradasi protein. Prinsip dari analisis total volatile base (TVB) adalah menguapkan senyawa-senyawa basa
22 volatil (amin, mono-, di-, dan trimetilamin). Senyawa tersebut kemudian diikat oleh asam borat dan kemudian dititrasi dengan larutan HCl. Preparasi sampel dilakukan dengan cara menimbang 15 gram sampel yang diambil dari bagian kulit ikan, kemudian ditambahkan 45 ml TCA 7 % dan dihomogenkan selama satu menit. Hasil homogenisasi kemudian disaring sehingga diperoleh filtrat yang berwarna jernih. Setelah penyiapan sampel, maka dilakukan uji TVB dengan cara memasukkan 1 ml H 3 BO 3 ke dalam inner chamber cawan conway dan tutup cawan diletakkan dengan posisi hampir menutupi cawan. Dengan memakai pipet 1 ml yang lain, filtrat dimasukkan ke dalam outer chamber disebelah kiri. Kemudian 1 ml larutan K 2 CO 3 jenuh ditambahkan ke dalam outer chamber sebelah kanan sehingga filtrat dan K 2 CO 3 tidak tercampur. Cawan segera ditutup dengan sebelumnya pinggir cawan diolesi vaselin agar proses penutupan sempurna, lalu digerakkan memutar sehingga kedua cairan di outer chamber tercampur. Disamping itu dikerjakan blanko dengan prosedur yang sama tetapi filtrat diganti dengan TCA 7 %. Kemudian kedua cawan conway tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Setelah diinkubasi, larutan asam borat dalam inner chamber cawan conway yang berisi blanko dititrasi dengan larutan HCl 0,032 N dan cawan digoyang-goyangkan perlahan sampai larutan asam borat berubah warna menjadi merah muda. Selanjutnya cawan conway yang berisi sampel juga dititrasi dengan larutan yang sama dengan blanko. Kadar TVB dapat dihitung dengan menggunakan rumus: %N (mg N/100 g) = (j i) x N HCl x 100 x fp x 14 mg N/100 g g contoh 1 Keterangan: j : ml titrasi sampel fp : faktor pengenceran i : ml titrasi blanko N : normalitas HCl (0,032 N) 3.4.4 Uji total plate count (TPC) (Fardiaz 1987) Prinsip kerja analisis TPC adalah penghitungan jumlah bakteri yang ada di dalam sampel (kulit ikan) dengan pengenceran sesuai kebutuhan dan dilakukan secara duplo. Pembuatan larutan contoh dilakukan dengan mencampurkan 10 gram sampel yang telah dihancurkan yang diambil dari bagian kulit ikan, lalu
23 dimasukkan ke dalam botol yang berisi 90 ml larutan garam 0,85 % steril, kemudian dikocok sampai larutan homogen. Campuran larutan contoh tersebut diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam botol berisi 9 ml larutan garam 0,85 % steril sehingga diperoleh contoh dengan pengenceran 10-2, setelah itu dikocok agar homogen. Banyaknya pengenceran dilakukan sesuai dengan keperluan penelitian, biasanya sampai pengenceran 10-5. Pemipetan dilakukan dari masing-masing tabung pengenceran sebanyak 1 ml larutan contoh dan dipindahkan ke dalam cawan petri steril secara duplo menggunakan pipet steril. Media agar dimasukkan ke dalam cawan petri sebanyak 10 ml dan digoyangkan sampai permukaan agar merata (metode tuang), kemudian didiamkan beberapa saat hingga dingin dan mengeras. Cawan petri yang telah berisi agar dan larutan contoh dimasukkan ke dalam inkubator pada suhu 35 0 C selama 48 jam dengan posisi cawan petri yang dibalik. Selanjutnya dilakukan pengamatan dengan menghitung jumlah koloni yang ada di dalam cawan petri tersebut. Jumlah koloni bakteri yang dihitung adalah cawan petri yang mempunyai koloni bakteri antara 30-300 koloni. 3.4.5 Ekstraksi enzim katepsin (Dinu et al. 2002) Penelitian tahap ini bertujuan untuk memperoleh ekstrak kasar enzim katepsin yang siap digunakan dalam pengujian selanjutnya. Ekstraksi katepsin dilakukan pada sampel P, Q, R, dan S pada setiap tahap kemunduran mutu. Proses ektraksi katepsin dilakukan dengan metode Dinu et al. (2002). Tahap pertama dilakukan preparasi sampel untuk memperoleh ekstrak kasar protease dengan mengambil sampel kulit ikan. Kulit ikan disuspensikan dalam akuades dengan perbandingan kulit ikan dan akuades sebesar 1:5, lalu dihomogenisasikan pada suhu 0-4 0 C. Ekstrak kulit hasil homogenisasi ini disentrifugasi pada 1.000 rpm selama 10 menit dan supernatan yang diperoleh kemudian disentrifugasi lagi pada 10.000 rpm selama 10 menit. Pelet yang dihasilkan dari sentrifugasi ini kemudian dilarutkan dalam 0,1 M buffer tris-hcl ph 7,4 dengan jumlah yang sama seperti jumlah akuades sebelumnya (1:5) dan disentrifugasi pada 4.000 rpm selama 10 menit. Supernatan (ekstrak kasar enzim) yang diperoleh merupakan protein utama dari mitokondria dan lisosom yang siap untuk diteliti aktivitasnya lebih lanjut.
24 3.4.6 Ekstraksi enzim kolagenase (Moore dan Stein 1954 diacu dalam Kim et al. 2002) Penelitian tahap ini bertujuan untuk memperoleh ekstrak kasar enzim kolagenase yang siap digunakan dalam pengujian selanjutnya. Ekstraksi kolagenase dilakukan pada sampel P, Q, R, dan S pada setiap tahap kemunduran mutu. Proses ekstraksi dilakukan dengan cara mencuci kulit ikan bandeng dengan air dingin, dan ditambahkan dengan 100 mm buffer Tris-HCl (ph 8,0), dengan perbandingan bahan baku dan larutan buffer 1:5, kemudian dihomogenkan dengan homogenizer. Selanjutnya kulit yang telah homogen tersebut, disentrifugasi dengan kecepatan 7.000 rpm selama 20 menit. Setelah itu, pelet yang telah dihasilkan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 7.000 rpm selama 20 menit menggunakan larutan buffer yang sama. Perbandingan antara bahan baku dan larutan buffer sebesar 1:3. Selanjutnya supernatan yang dihasilkan ditambahkan dengan 20 mm Tris-HCl (ph 8,0) yang mengandung 0,36 mm CaCl 2, dan didiamkan pada suhu rendah (± 4 0 C) selama 48 jam. Larutan yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar kolagenase yang akan digunakan untuk pengujian selanjutnya. 3.5 Assay Aktivitas Enzim Katepsin (Dinu et al. 2002) Aktivitas proteolitik dari enzim katepsin diuji menggunakan hemoglobin terdenaturasi asam sebagai substratnya. Sebanyak 8 % hemoglobin dilarutkan dalam akuades dengan perbandingan 1:3. Kemudian ph dibuat menjadi 2,0 dengan HCl 1 N dan konsentrasi akhir hemoglobin dibuat sebesar 2 % dengan akuades. Selanjutnya 1 ml dari larutan substrat dengan 0,2 ml larutan enzim direaksikan dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37 0 C. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2 ml TCA 5 %. Campuran disaring dan hasil reaksi yang didapat ditambah dengan 1 ml pereaksi folin serta diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 750 nm. Selain itu dilakukan pula pengukuran untuk larutan blanko dan larutan standar dengan prosedur yang sama seperti larutan sampel hanya untuk larutan blanko dan larutan standar enzimnya digantikan dengan akuades dan tirosin. Aktivitas enzim katepsin dapat dihitung dengan rumus berikut:
25 UA = Asp Ast Abl 1 xpx Abl T UA : jumlah enzim yang menyebabkan Asp : nilai absorbansi sampel perubahan 1 μmol substrat per menit Asp : nilai absorbansi sampel Abl : nilai absorbansi blanko Ast : nilai absorbansi standar P : faktor pengenceran T : waktu inkubasi 3.6 Assay Aktivitas Enzim Kolagenase (Moore dan Stein 1954 diacu dalam Kim et al. 2002) Aktivitas kolagenolitik dapat diukur dengan metode Moore dan Stein (1954) dalam Kim et al. (2002) yang telah dimodifikasi dengan cara mereaksikan 5 ml kolagen dari kulit ikan dengan 1 ml 0,05 M Tris-HCl (ph 7,5) yang mengandung 5 mm CaCl 2 dan 0,1 ml larutan enzim lalu diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 1 jam. Reaksi dihentikan dengan penambahan 0,2 ml 5 % TCA. Setelah 10 menit pada suhu ruang, larutan disaring dengan menggunakan kertas saring. Supernatan (0,2 ml) dicampur dengan 1,0 ml larutan nynhidrin, diinkubasi pada suhu 100 0 C selama 20 menit. Kemudian didinginkan pada suhu kamar. Campuran tersebut diencerkan dengan 5 ml 50 % 1-propanol untuk pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm. Larutan buffer (0,05 M Tris-HCl ph 7,5) yang mengandung 5 mm CaCl 2 digunakan sebagai pengganti larutan enzim sebagai larutan kontrol dan larutan tirosin digunakan sebagai larutan standar enzim kolagenase. Aktivitas enzim kolagenase dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: UA = Asp Ast Abl 1 xpx Abl T UA Asp Abl Ast P T : jumlah enzim yang menyebabkan perubahan 1 μmol substrat per menit : nilai absorbansi sampel : nilai absorbansi blanko : nilai absorbansi standar : faktor pengenceran : waktu inkubasi
26 3.7 Pengukuran Konsentrasi Protein Enzim (Bradford 1976) Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford dengan bovine serum albumin sebagai standar. Persiapan pereaksi Bradford dilakukan dengan cara melarutkan 25 mg coomasie brilliant blue G-250 dalam 12,5 ml etanol 95 %. Lalu ditambahkan dengan 25 ml asam fosfat 85% (b/v). Jika telah larut dengan sempurna, maka ditambahkan akuades hingga 0,5 l dan disaring dengan kertas saring Whatman-1 sesaat sebelum digunakan. Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford dengan cara 0,1 ml enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan sebanyak 5 ml pereaksi Bradford, diinkubasi selama 5 menit dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Demikian pula untuk larutan standar dilakukan seperti larutan sampel dengan konsentrasi antara 1,0-1,0 mg/ml dari larutan stok BSA konsentrasi 2 mg/ml. Tabel pembuatan larutan standar BSA 0,1-1,0 mg/ml disajikan pada Tabel 6. Tabel 6. Pembuatan larutan standar BSA konsentrasi 0,1-1,0 mg/ml Konsentrasi BSA (mg/ml) Volume BSA (ml) Volume akuades (ml) 0,1 0,05 0,95 0,2 O,10 0,90 0,3 0,15 0,85 0,4 0,20 0,80 0,5 0,25 0,75 0,6 0,30 0,70 0,7 0,35 0,65 0,8 0,40 0,60 0,9 0,45 0,55 1,0 0,50 0,50 Nilai absorbansi yang didapat kemudian dimasukkan ke dalam kurva standar Bradford untuk menentukan konsentrasi protein yang terkandung dalam sampel enzim (Lampiran 4).
27 3.8 Analisis Data Hasil yang diperoleh dari pengamatan serta pengukuran terhadap nilai organoleptik, ph, TVB dan TPC serta aktivitas enzim katepsin dan kolagenase, serta konsentrasi protein enzim dicari nilai rata-ratanya. Nilai rata-rata tersebut dihitung menggunakan rumus berikut (Steel dan Torrie 1989): Keterangan : X : nilai rata-rata Xi : nilai X ke-i N : jumlah data Analisis terhadap hubungan tingkat kesegaran ikan (TPC, TVB, dan nilai ph), nilai aktivitas enzim dan konsentrasi protein enzim dilakukan melalui uji ragam (ANOVA) berupa rancangan acak kelompok dengan 4 perlakuan (sampel P, Q, R, dan S) dan 4 kelompok (pre rigor, rigor mortis, post rigor, dan busuk). Persamaan umum model rancangan tersebut sebagai berikut: Y ij = µ + τ i + β j + ε ij Keterangan: Y ij : nilai pengamatan pada perlakuan ke-i kelompok ke-j µ : nilai tengah populasi τ i β j ε ij X n i = 1 = n Xi : pengaruh perlakuan τ taraf ke-i : pengaruh kelompok β taraf ke-j : galat percobaan pada perlakuan ke-i kelompok ke-j Hipotesis yang digunakan adalah: 1. Hipotesis perlakuan a. H 0 : pengaruh perlakuan tidak berbeda nyata b. H 1 : minimal ada 1 perlakuan yang memberikan pengaruh berbeda nyata 2. Hipotesis kelompok a. H 0 : pengaruh kelompok tidak berbeda nyata b. H 1 : minimal ada 1 kelompok yang memberikan pengaruh berbeda nyata Apabila pengaruh perlakuan dan kelompok berbeda nyata dengan selang kepercayaan 95 % (p <0.05), maka diadakan uji lanjut Duncan (Steel dan Torrie 1989).
n Xi i = 1 X = n 28 Derajat hubungan linier antara aktivitas enzim (katepsin dan kolagenase) terhadap parameter kesegaran mutu (nilai organoleptik, ph, TVB, TPC) dilihat menggunakan koefisien korelasi linier sederhana dengan rumus (Snedecor dan Cochran 1967): r = xy 2 2 ( x )( y ) Keterangan: x : simpangan dari rataan peubah pertama (yang mempengaruhi) y : simpangan dari rataan peubah kedua (yang dipengaruhi) Nilai derajat korelasinya adalah: r =>0,7 : hubungan sangat erat 0,5<= r <=0,7 : hubungan erat r <=0,5 : hubungan tidak erat