16 BAB III METODOLOGI PENELITIAN Penelitian akan diawali dengan preparasi alat dan bahan untuk sampling sel folikel akar rambut. Sampel kemudian dilisis, diamplifikasi dan disekuensing dengan metode dideoksi Sanger. Hasil sekuensing kemudian dianalisis sehingga diperoleh data variasi mutasi daerah HVI mtdna. 3.1 Bagan Alir Penelitian Garis besar keseluruhan tahapan penelitian yang akan dilakukan dapat dilihat pada Gambar 3.1. Sampel mtdna (sel folikel akar rambut) Templat mtdna Lisis sampel Fragmen mtdna daerah Hipervariabel I (HVI) Amplifikasi dengan teknik PCR Deteksi dengan elektroforesis gel Sekuensing Urutan nukleotida mtdna daerah Hipervariabel I(HVI) Analisis hasil sekuensing dengan program DNAstar versi 4 Variasi muatasi daerah HVI mtdna pada populasi dataran tinggi Gambar 3.1. Bagan Alir Penelitian Secara Garis Besar.
17 3.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, pipet mikro + tip 0.5-10 µl, pipet mikro+ tip 10-100 µl, tabung eppendorf 200 µl, tabung eppendorf 500 µl, tabung eppendorf 1500 µl, gelas kimia 50 ml, gelas kimia 100mL, gelas kimia 500mL, water bath, thermometer, microsentrifuge, mesin GeneAmp PCR System 2700, set alat elektroforesis, dan lampu UV. Alat-alat seperti cawan petri, tabung eppendorf dan tip disterilisasi sebelum dipakai. Adapun bahan-bahan yang digunakan adalah sel folikel akar rambut, etanol teknis, buffer lisis (500 mm Tris-HCl ph 8,5, 10 mm EDTA ph 8, dan 5% Tween-20), enzim proteinase K, ddh 2 O, primer M1 (20pmol/µL), primer HV2R (20pmol/µL), buffer PCR 10 x (500 mm KCl, 100 mm Tris-HCl ph 9,0 pada suhu 25 C, 1% Triton X-100, 20 mm MgCl 2 ), enzim Taq DNA Polimerase (5 unit/µl), campuran dntp (10mM), agarosa, buffer TAE 1 x, larutan EtBr, loading buffer (sukrosa 50%, EDTA 0,1 M ph 8, bromfenol biru 0,1% ph 8), dan marker. 1.3 Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Riset (Research Laboratory) Jurusan Pendidikan Kimia (Gedung JICA lantai 5), laboratorium Mikrobiologi Jurusan Pendidikan Biologi (Gedung JICA lantai 2) FPMIPA Universitas Pendidikan Indonesia (UPI), Jl. Dr. Setiabudhi No.229 Bandung, dan Laboratorium Biokimia Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung (ITB).
18 3.4 Pengumpulan Sampel Mentah mtdna Manusia Pengumpulan sampel dilakukan pada minggu ke-1 bulan Maret 2010 di dataran tinggi Gunung Papandayan yang mempunyai ketinggian 2400 dpl. Sampel diperoleh dengan mengambil ±7 helai sel folikel akar rambut dari 20 penduduk sekitar. Pengambilan sel akar rambut menggunakan pinset, dan sarung tangan. Sel folikel akar rambut dimasukkan kedalam plastik obat yang telah diberi kode sampel dan disimpan ke dalam thermos es, sebelum dimasukkan ke dalam lemari es. 3.5 Penyiapan Templat dengan Lisis Sel Templat mtdna yang akan diamplifikasi diperoleh dari hasil lisis sel folikel akar rambut. Sel akar rambut dari sampel diambil menggunakan pinset. Dipotong bagian akar rambutnya sekitar 7 mm pada cawan petri menggunakan ujung pinset. Masukkan potongan sel folikel akar rambut ke dalam tabung eppendorf 1500µL, kemudian ditambahkan ddh 2 O 170 µl, buffer lisis sebanyak 20 µl, dan enzim proteinase K sebanyak 10 µl. Selanjutnya, tabung eppendorf dibungkus dengan parafilm, dan dilisis selama satu jam pada suhu 55 o C. Dideaktivasi selama 10 menit pada suhu 95 o C dan disentrifuse selama tiga menit pada kecepatan 14000 rpm. Setelah proses sentrifugasi, diambil supernatannya sebanyak ± 150 µl dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1500 µl yang baru.
19 3.6 Amplifikasi mtdna Daerah D-loop Amplifikasi mtdna daerah D-loop mtdna manusia dilakukan dengan proses PCR. Pereaksi PCR yang terdiri dari 5 µl templat mtdna hasil lisis; 0,5 µl primer M1 (20 pmol/µl); 0,5 µl primer HV2R (20 pmol/µl); 2,5 µl buffer PCR 10 x (500 mm KCl, 100 mm Tris-HCl ph 9 pada suhu 25 C; 1,0% Triton X- 100; 15 mm MgCl 2 ); 0,2 µl enzim Taq DNA Polimerase (5 unit/µl); 0,5 µl campuran dntp 10 mm; dan ditambah 15,8 µl ddh 2 O steril sehingga volumenya mencapai 25µL. Semua pereaksi PCR selain templat mtdna biasa disebut master mix. Master mix 20µL dimasukkan dalam tabung eppendorf 200µL kemudian ditambahkan templat mtdna 5µL, kemudian siap dimasukkan kedalam alat PCR. Adapun urutan rinci nukleotida primer M1 dan HV2R yang digunakan dalam proses PCR dapat dilihat pada Tabel.3.1. Tabel 3.1. Urutan nukleotida primer M1 dan HV2R. Primer Urutan 5 ke 3 Ukuran M1 -CACCATTAGCACCCAAAGCT- 20 nukleotida HV2R -CTGTTAAAAGTGCATACCGCC- 21 nukleotida Proses PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dengan menggunakan mesin GeneAmp PCR System 2700. Tiap tahap siklus terdiri dari tahap denaturasi pada suhu 94 C selama satu menit, tahap annealing pada suhu 50 C selama satu menit dan tahap polimerase pada suhu 72 C selama 1 menit. Sebelum siklus berjalan dibutuhkan waktu 5 menit untuk melakukan tahap denaturasi awal, dan pada akhir siklus diperlukan tahapan polimerasi tambahan selama 4 menit. Setelah semua
20 tahapan selesai, DNA hasil PCR disimpan pada suhu 4 C dalam mesin. Tahapan proses PCR dapat dilihat pada Gambar 3.2. 94ºC 94ºC 5 1 72ºC 1 72ºC 4 50ºC 1 30 siklus Gambar 3.2. Tahapan Proses PCR. 4ºC ~ 3.7 Deteksi Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa Deteksi hasil PCR dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1% (h/v) menggunakan alat mini sub TM DNA Electrophoresis cell (TM minicell). Gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0,15 g agarosa dalam 15mL buffer TAE 1x. Larutan tersebut dipanaskan menggunakan pemanas hingga seluruh agarosa larut pada suhu ± 80 C. Didinginkan larutan mencapai suhu ± 60 C dan ditambahkan 2 µl larutan EtBr sambil diaduk hingga EtBr homogen dalam larutan gel. Larutan gel dituangkan ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir untuk membuat sumur. Setelah gel mengeras, buka sisir dari cetakan, kemudian dimasukkan 5 µl sampel hasil PCR yang telah dicampur dengan 2 µl loading buffer ke dalam masingmasing sumur.
21 Pada proses elektroforesis ini buffer TAE 1 x digunakan sebagai running buffer atau media penghantar arus pada tegangan 100 volt selama ± 25 menit. Hasil elektroforesis divisualisasi dengan lampu UV seri 9814-312 nm (Cole Parmer) di dalam ruangan khusus. Penentuan konsentrasi DNA dapat dilakukan dengan cara membandingkan intensitas pita yang dianalisis terhadap pita-pita dari marker yang konsentrasinya telah ditentukan sebelumnya. Marker yang digunakan adalah puc19/hinfi, yaitu plasmid puc19 yang dipotong dengan enzim retriksi HinfI. Marker ini memiliki lima pita yang masing-masing berukuran 1419 pb, 517 pb, 396 pb, 214 pb, dan 75 pb (Halimatul, 2005 dalam Lestari, 2008). 3.8 Sekuensing Sekuensing DNA adalah proses untuk menentukan urutan nukleotida fragmen hasil amplifikasi dengan PCR. Sekuensing ini dilakukan dengan metode dideoksi sanger menggunakan Automatic DNA Sequence yang berdasarkan pada metode dye terminator labeling dengan bahan serta zat pereaksi dari DYEnamic ET terminator cycle sequencing kit (Amersham Bioscience, 2003). Tahapan sekuensing dilakukan di laboratorium Macrogen, Inc Advancing Through Genomics Korea. Sampel berupa fragmen mtdna didalam tabung eppendorf 500 µl ditambah primer yang digunakan, dikirim ke laboratorium ini. Tahapan sekuensing DNA yang akan dilakukan meliputi penyiapan DNA templat, reaksi sekuensing menggunakan primer M1, pemurnian hasil sekuensing dengan kolom sephadex G-50, elektroforesis pada gel poliakrilamida dan pembacaan elektroforegram hasil sekuensing menggunakan alat Sequencing DNA
22 Analyzer. Prinsip alat Sequencing DNA Analyzer adalah merekam sinyal yang diinduksi oleh sinar laser dan membaca fragmen-fragmen berdasarkan serapan gelombangnya (Halimatul, 2005). Pembacaan hasil sekuensing dapat dilihat dari data elektroforegram yang menunjukkan warna dan tinggi puncak yang berbeda untuk tiap basa. Untuk basa A berwarna hijau, basa G berwarna hitam, basa C berwarna biru dan basa T berwarna merah. Analisis urutan nukleotida hasil sekuensing dilakukan menggunakan program DNAstar versi 4.