III. Bahan dan Metode A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan selama 3 bulan dari bulan Mei-Juli 2011 yang dilakukan di LPPT UGM Yogyakarta. B. Bahan Penelitian Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah DNA dari darah manusia yang diperoleh dari tujuh orang mahasiswa yang telah bersedia di ambil darahnya. Tujuh orang Mahasiswa ini, asli berasal dari suku mereka masing-masing, suku-suku yang diambil merupakan perwakilan tujuh besar suku-suku yang di ada Papua. Mereka yang bersedia diambil darahnya adalah mahasiswa yang berasal dari Papua yang sedang kuliah di Salatiga. Sampel-sampel DNA ini diberi kode dengan angka 1-7, yang dapat dilihat pada table 1. 13
Tabel 1. Keterangan sampel dan asal suku Kode sampel Keterangan suku 1 Ayamaru (Kabupaten Sorong) 2 Danny (Kabupaten Jaya Wijaya) 3 Yally (Kabupaten Jaya Wijaya) 4 Mapi (Kabupaten Merauke) 5 Paniai (Kabupaten Nabire) 6 Yapen (Kabupaten Yapen/Serui) 7 Biak (Kabupaten Biak) Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah: larutan buffer, proteinase K, larutan SDS 10%, NaCl, ethanol, TE, dan akuades. Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain PCR dan alat Elektroforesis. C. Metode 1. Isolasi DNA dari darah Sebelum melakukan isolasi DNA, terlebih dahulu diambil sampel DNA yang berasal dari darah. Diambil darah sebanyak 5 ml yang berasal dari pembuluh vena dari masing-masing mahasiswa. Setelah proses pengambilan darah baru dilakukan metode isolasi DNA dengan cara diambil 1,5 ml darah ditambahkan EDTA dan 6 ml larutan buffer EL kemudian dihomogenkan dengan diinkubasi pada suhu 40 C selama 30 menit. Setelah itu 14
disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm, supernatan dibuang dan pellet ditambahkan dengan 5 ml buffer SE 1x divortex kemudian di sentrifuge lagi. Pellet yang diperoleh ditambahkan dengan 2 ml buffer EL 1x, 40 µl proteinase K dan 200 µl SDS 10% dan diinkubasi pada suhu 37⁰C semalam. Tambahkan 1 ml NaCl 6 mm, kemudian disentrifuge lagi, supernatan diambil dan dicuci dengan 8 ml ethanol absolute (96%) dingin, campur perlahanlahan akan terbentuk benang-benang DNA diambil dan ducuci dengan 2 ml ethanol 70%, kemudian disentrifuge lagi buang supernatan dan pellet dikeringkan dari sisa alkohol, tambahkan TE 1x dan disimpan dalam frezzer pada suhu 4 C. 2. Analisis dan Penentuan Kadar Konsentrasi DNA DNA hasil isolasi, diambil 20 µl dan di spektro. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 260-280 nm dengan alat spektrofotometer UV-VIS. 3. Elektroforesis Untuk melakukan elektroforesis terlebih dahulu dibuat gel agarose dengan konsentrasi 2%. Pembuatan gel agarose 2% dilakukan dengan melarutkan 0,5 gr agarose dalam 25 ml larutan dapar Tris-Boric acid (TBE) 1x lalu dipanaskan sampai homogen (jernih) dan ditambahkan dengan 2 µl larutan etidium bromide (EB). 15
Larutan gel dituang dalam cetakan dengan sisir cetakan yang dipasang dengan posisi tegak hingga melewati sisir. Gel dibiarkan beberapa saat sampai mengeras. Setelah itu gel direndam dalam larutan buffer TBE 0,5x. Gel kemudian dielektroforesis dengan voltase sebesar 100v selama ± 60 menit. Ambil 5 µl DNA dari hasil isolasi, tambahkan 2 µl loading buffer, masukkan sampel dalam slab gel kemudian dielektroforesis (running) pada tegangan 100 volt selama 1 jam. 4. Identifikasi dengan Reaksi Berantai Polimerase (PCR) Untuk identifikasi selanjutnya dilakukan dengan metode PCR, metode ini dilakukan dua kali dengan suhu dan link yang berbeda yang berbeda. Sampel 1-3 pada suhu 55 C dengan link 33 dan sampel 4-7 pada suhu 50 C dengan link 47. untuk sampel 1-3 pada suhu 55 C, diprogram pada link 33 yang terdiri dari proses denaturasi pada 95 C selama 5 menit, kemudian 35 siklus (annealing pada 55 C selama 1 menit, extension pada 72 C selama 1 menit dan denaturasi kembali pada 95 C selama 5 menit) dan 72 C selama 5 menit. Sedangkan untuk sampel 4-7 pada suhu 50 C diprogram pada link 47 yang terdiri dari proses denaturasi pada suhu 95 C selama 5 menit, kemudian 35 suklus (annealing pada 16
50 C selama 1 menit, extension pada 72 C selama 1 menit dan denaturasi kembali pada suhu 95 C selama 1 menit) dan 72 C selama 5 menit. Primer yang digunakan untuk PCR adalah primer M9 (5'- GCAGCATATAAAACTTTCAGG-3') (Kayser et al, 2000). Campuran bahan-bahan yang digunakan yaitu H2O.RNAse (20 µl), primer M9 (2 µl), DNA template pengenceran 50x (sesuai konsentrasi masing-masing sampel) sehingga total volume 25 µl. Bahan-bahan tersebut dicampur dalam tabung PCR 0,2 ml. Visualisasi produk PCR ini dilakukan melalui elektoforesis dengan cara memasukkan 7,5 µl produk PCR yang ditambahkan dengan 2 µl loading buffer (buffer warna) ke dalam sumur gel agarose 2%. Setelah proses elektroforesis, pita hasil PCR dapat dilihat dengan alat UV transluminator. 17