TINJAUAN PUSTAKA Botani Tanaman Menurut Tjitrosoepomo (1989) tanaman kacang hijau termasuk suku (famili) Fabaceae. Kedudukan tanaman kacang hijau dalam taksonomi tumbuhan diklasifikasikan sebagai berikut. Kingdom Divisi Subdivisi Kelas Ordo Famili Genus : Plantae. : Spermatophyta. : Angiospermae. : Dicotyledonae. : Fabales. : Fabaceae : Phaseolus. Spesies : Phaseolus radiatus L. Kacang hijau merupakan tanaman pangan semusim berupa semak yang tumbuh tegak. Tanaman kacang hijau ini diduga berasal dari India. Tanaman kacang hijau adalah tanaman semusim berumur pendek (60 hari). Batang kacang hijau berbentuk bulat dan berbuku-buku. Ukuran batang kecil kecil, berbulu, berwarna hijau kecoklatan atau kemerahan. Daun kacang hijau tumbuh majemuk, terdiri dari tiga helai anak daun setiap tangkai. Helai daun berbentuk oval dengan bagian ujung lancip dan berwarna hijau muda hingga hijau tua. Bunga kacang hijau berbentuk seperti kupu-kupu dan berwarna kuning kehijauan. Bunga termasuk hermafrodit atau berkelamin dua. Buah kacang hijau berbentuk silindris dengan panjang antara 5 16 cm dan berbulu pendek. Setiap polong berisi 10 15 biji. Biji kacang hijau berbentuk bulat. Biji kacang hijau mempunyai bobot hanya sekitar 0,5 0,8 mg (Purwono dan Hartono, 2005).
5 Daun terdiri dari tiga helai (trifoliat) dan letaknya berseling. Tangkai daun lebih panjang dari daun dengan warna daun hijau muda sampai hijau tua. Bunga berwarna kuning tersusun dalam tandan, muncul pada cabang serta batang, dan dapat menyerbuk sendiri. Polong berbentuk silindris dengan panjang antara 6-15 cm dan berbulu pendek. Sewaktu muda berwarna hijau dan berubah hitam atau coklat ketika tua, dengan isi polong 10 15 biji (Andrianto dan Indarto, 2004). Tanaman kacang hijau berakar tunggang. Sistem perakaran dibagi menjadi dua, yaitu mesopita dan seropita. Mesopita mempunyai banyak cabang akar pada permukaan tanah dan tipe pertumbuhannya menyebar. Sementara seropita memiliki akar cabang lebih sedikit dan memanjang ke arah bawah (Purwono dan Hartono, 2005). Kultur Jaringan Kultur jaringan atau budidaya in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan atau organ yang serba steril, ditumbuhkan pada media buatan yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam kondisi yang aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap. Dasar teori yang digunakan adalah teori totipotensi. Totipotensi adalah bagian tanaman yang hidup mempunyai potensi, kalau dibudidayakan di dalam media yang sesuai, akan dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang sempurna, artinya dapat bereproduksi, berkembang biak secara normal melalui biji atau spora (http://e-learning.unram.ac.id, 2008). Teknik kultur jaringan menuntut syarat-syarat tertentu yang harus dipenuhi dalam pelaksanaannya. Syarat pokok pelaksanaan kultur jaringan, adalah laboratorium dengan segala fasilitasnya. Laboratorium harus menyediakan alat-
6 alat kerja, sarana pendukung terciptanya kondisi aseptik terkendali, dan fasilitas dasar seperti: air, listrik, dan bahan bakar. Kultur jaringan sangat membantu dalam usaha eliminasi patogen. Dengan metode ini kita dapat memilih bagianbagian atau sel-sel yang tidak mengandung patogen, terutama virus, dan menumbuhkan sel-sel tersebut serta meregenerasikannya kembali menjadi tanaman lengkap dan sehat (Gunawan, 1988). Zat Pengatur Tumbuh Dalam kultur jaringan, dua golongan zat pengatur tumbuh yang sangat penting adalah sitokinin dan auksin. Zat pengatur tumbuh ini mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan, dan organ. Interaksi dan perimbangan antara zat pengatur tumbuh yang diberikan dalam media dan yang diproduksi oleh sel secara endogen menentukan arah perkembangan suatu kultur. Penambahan auksin atau sitokinin eksogen, mengubah level zat pengatur tumbuh endogen sel. Level zat pengatur tumbuh endogen ini kemudian merupakan trigerring factor untuk proses-proses tumbuh dan morfologi (Gunawan, 1988). Pengaruh dari suatu zat pengatur tumbuh bergantung pada spesies tumbuhan, situs aksi ZPT pada tumbuhan, tahap perkembangan tumbuhan dari konsentrasi ZPT. Satu ZPT tidak bekerja sendiri dalam mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan, pada umumnya keseimbangan konsentrasi dari beberapa ZPT yang akan mengontrol pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan (http://www.iel,ipb.ac.id, 2008). Zat pengatur tumbuh memegang peranan penting dalam pertumbuhan dan perkembangan kultur. Faktor yang perlu mendapat perhatian dalam
7 penggunaan zat pengatur tumbuh antara lain jenis zat pengatur tumbuh yang akan digunakan, konsentrasi, urutan penggunaan, dan periode masa induksi dalam kultur tertentu (Gunawan, 1995). Dalam pengkulturan untuk merangsang pembentukaan akar pada tunas, biasanya menggunakan ZPT auksin. Jenis yang sering digunakan untuk pengakaran in vitro adalah IBA dan NAA, karena efektifitasnya tinggi dan harganya relatif murah (Yusnita, 2003) Sitokinin dalam kultur jaringan berfungsi untuk mengatur pertumbuhan serta morfogenesis. Sitokinin diproduksi dalam akar. Itulah sebabnya sitokinin tidak perlu ditambahkan dalam media jika yang dikulturkan akar (Katuuk, 1989). Dilaporkan bahwa sitokinin dapat mengatur keseimbangan sel. Sitokinin dalam jumlah yang banyak dapat merangsang pertumbuhan tunas tetapi menekan pertumbuhan tinggi tanaman serta merangsang pertumbuhan akar (George and Sherrington, 1995). Penambahan sitokinin dalam jumlah yang banyak dapat mengakibatkan batang tanaman bertambah besar, daun kecil dan pucat. Auksin dalam kultur jaringan berperan dalam merangsang pertumbuhan kalus, pembesaran sel, pertumbuhan akar, dan mengatur morfogenesis (Santoso dan Nursandi, 2001). Sitokinin mempengaruhi berbagai proses fisiologis di dalam tanaman. Aktivitas yang terutama ialah mendorong pembelahan sel dan aktivitas ini yang menjadi kriteria utama untuk menggolongkan suatu zat ke dalam sitokinin. Akan tetapi proses-proses pembelahan sel pada sel-sel meristem akan menghambat oleh pemberian sitokinin eksogen. Baik efek yang menghambat maupun efek yang mendorong proses pembelahan sel oleh sitokinin tergantung dari adanya
8 fitohormon lainnya, terutama auksin. Tidak diketahui perbandingan sitokinin dan auksin yang bagaimana yang merangsang atau menghambat proses pembelahan sel. Sitokinin juga berpengaruh didalam perkembangan embrio. Air kelapa (coconut milk) telah lama diketahui sebagai sumber yang kaya akan zat-zat aktif yang diperlukan untuk perkembangan embrio. Di antara zat-zat yang aktif terdapat sitokinin endogen. Pada air kelapa ini dapat dilihat suatu interaksi antara sitokinin dengan fitohormon lainnya di dalam proses perkembangan embrio itu. Sitokinin memperlambat proses penghancuran butir-butir klorofil pada daun-daun yang terlepas dari tanaman (detached leave) dan memperlambat proses senescence pada daun, buah, dan organ-organ lainnya. Warna kuning ini disebabkan oleh perombakan butir-butir klorofil, tetapi sitokinin mengaktifkan beberapa proses metabolisme pada tempat pemberian sitokinin itu dan menghambat perombakan dari butir-butir klorofil dan protein (Wattimena, 1987). Pengaruh auksin dan hormon tumbuh lainnya dalam mengatur pertumbuhan atau pembentukan daun belum diketahui dengan jelas, sedangkan kerja atau peranan sitokinin sendiri belum dimengerti dan tidak cukup bukti-bukti yang jelas untuk menguatkan hasil dari suatu proses biokimia (Davies, 1987). Faktor-faktor Yang Mempengaruhi Kultur Jaringan Eksplan Dalam perbanyakan tanaman secara kultur jaringan, eksplan merupakan faktor penting penentu keberhasilan. Umur fisiologis, umur ontogenetik, ukuran eksplan, serta bagian tanaman yang diambil merupakan hal-hal yang harus dipertimbangkan dalam memilih eksplan yang akan digunakan sebagai bahan awal
9 kultur. Umumnya, bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan adalah jaringan muda yang sedang tumbuh aktif. Jaringan tanaman yang masih muda mempunyai daya regenerasi lebih tinggi, sel-sel masih aktif membelah diri, dan relatif lebih bersih (mengandung lebih sedikit kontaminan) (Yusnita, 2003). Penggunaan embrio tanaman sebagai eksplan dikenal dengan kultur embrio yang memisahkan embrio tanaman yang belum dewasa dan menumbuhkannya secara kultur jaringan untuk mendapatkan tanaman yang viable. Faktor-faktor yang mempengaruhi kultur embrio yaitu genotip, hasil perkembangan embrio setelah diisolasi, kondisi tanaman induk, zat hara dalam media, cahaya dan suhu (Gunawan, 1988). Media Kultur Jaringan Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan (Yusnita, 2003). Hampir dapat dipastikan bahwa kesuksesan kegiatan kultur jaringan akan sangat ditentukan dan tergantung oleh pilihan media yang digunakan. Harus diingat bahwa teknik kultur jaringan menekankan lingkungan yang cocok agar eksplan dapat tumbuh dan berkembang. Lingkungan yang cocok, sebagian akan terpenuhi bila media yang dipilih mempertimbangkan apa-apa yang diperlukan oleh tanaman. Secara umum kebutuhan nutrisi kebanyakan tanaman sama, tetapi secara khusus hal tersebut berbeda. Kesamaannya adalah tanaman memerlukan hara makro dan mikro, vitamin-vitamin, karbohidrat (gula), asam amino dan N-organik, zat pengatur tumbuh, zat pemadat dan kadang ada penambahan bahan-bahan
10 seperti air kelapa, ekstrak ragi, jus tomat, ekstrak kentang, buffer organik, ataupun arang aktif. Kebutuhan tiap tanaman berbeda pada hal komposisi dan jumlah yang diperlukan (Santoso dan Nursandi, 2001). Lingkungan Kondisi lingkungan yang menentukan keberhasilan pembiakan tanaman dengan kultur jaringan meliputi cahaya, suhu, dan komponen atmosfer. Cahaya dibutuhkan untuk mengatur proses morfogenetik tertentu. Dalam teknik kultur jaringan tanaman, cahaya dinyatakan dengan dimensi lama penyinaran, intensitas, dan kualitasnya. Murashige (1962) dalam Gunawan (1995) menyarankan untuk mengasumsikan kebutuhan lama penyinaran pada kultur jaringan tanaman merupakan pencerminan dari kebutuhan periodisitas tanaman yang bersangkutan di lapangan. Kualitas cahaya mempengaruhi arah diferensiasi jaringan. Energi radiasi mendekati spektrum ultra violet dan biru merupakan kualitas cahaya yang paling efektif untuk merangsang pembentukan tunas, sedangkan pembentukan akar dirangsang oleh cahaya merah dan sedikit cahaya biru. Untuk itu, pada tahap inisiasi dan multiplikasi tunas digunakan pencahayaan dengan lampu fluorescent (TL). Secara umum, intensitas cahaya yang optimum untuk tanaman pada kultur tahap inisiasi kultur adalah 0-1.000 lux, tahap multiplikasi sebesar 1.000-10.000 lux, tahap pengakaran sebesar 10.000-30.000 lux, dan tahap aklimatisasi sebesar 30.000 lux (Yusnita, 2003). Suhu juga berpengaruh terhadap kesehatan tanaman yang dikulturkan. Suhu yang umum digunakan untuk pengkulturan berbagai jenis tanaman adalah 26 + 2 0 C. Untuk kebanyakan tanaman, suhu yang terlalu rendah(kurang dari 20 0 C) dapat menghambat pertumbuhan, dan suhu yang terlalu tinggi (lebih dari 32
0 C) menyebabkan tanaman merana. Namun, pada kultur tanaman yang biasanya 11 memerlukan suhu rendah untuk pertumbuhan terbaiknya, seperti stroberi, suhu yang diperlukan juga lebih rendah (Yusnita, 2003). Faktor penting lain yang juga perlu mendapat perhatian, adalah ph yang harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan ph dari sitoplasma. Pengaturan ph selain memperhatikan kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor kelarutan dari garam-garam penyusun media, pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain, dan efisiensi pembekuan agar-agar. Sel-sel tanaman membutuhkan ph yang sedikit asam berkisar antara 5.5-5.8 (Gamborg dan Shyluk 1981). Pengaturan ph, biasa dilakukan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCl pada waktu semua komponen sudah dicampurkan, seringkali setelah sterilisasi ph-nya berubah. Pada umumnya terdapat penurunan ph setelah disterilkan dalam autoclave. Untuk mencapai ph sekitar 5.7-5.9, George dan Sherrington (1984) membuat ph 7.0 dalam media yang belum disterilkan. Untuk menghindarkan perubahan ph yang cukup besar, Murashige dan Skoog (1962) dalam George dan Sherrington (1984) menyarankan agar dilakukan pemanasan untuk melarutkan agar-agar dan memanaskan beberapa menit media dalam autoclave, baru diadakan penetapan ph. Cara lain yang dilakukan adalah penetapan ph setelah media disterilkan dalam autoclave. Dalam wadah yang besar media disterilkan dan kemudian dititrasi dengan NaOH/HCl steril sampai ph yang diinginkan. Selanjutnya media dituang ke dalam wadah kultur steril yang telah dipersiapkan di dalam laminar air flow cabinet. Cara ini juga digunakan pada
12 penelitian yang menggunakan media dengan ph rendah untuk tujuan seleksi (Gunawan, 1988). Senyawa Kompleks Alami Disamping golongan persenyawaan organik yang konstitusinya jelas, dalam media kultur juga kadang-kadang ditambahkan persenyawaan yang kompleks, yang komposisinya dapat berbeda dari sumber yang satu dengan yang lainnya. Persenyawaan kompleks yang dimaksud adalah air kelapa, casein hydrolysate, ekstrak ragi, juice tomat, ekstrak kentang, dan ekstrak pisang. Penggunaan air kelapa pertama kali dilaporkan oleh Van Overbeek (1941) dalam George dan Sherrington (1984) pada kultur embrio Datura stramonium. Selanjutnya Gautheret (1942) dalam George dan Sherrington (1984) menemukan bahwa air kelapa dapat digunakan untuk mempertahankan pertumbuhan jaringan yang diisolasi dari sumber yang berlainan. Caplin dan Steward (1951) dalam George dan Sherrington (1984) memperoleh pertumbuhan kalus dari kultur tanaman wor-tel yang lebih baik pada media dengan 5 % air kelapa dan caseinhydrolysate dari pada media dengan IAA. Penelitian yang mendalam menemukan bahwa efek air kelapa pada pertumbuhan menjadi lebih baik bila dalam media juga diberikan auksin. Auksin tertentu dan air kelapa, dapat bersifat sinergis. Steward dan Caplin (1951) dalam George dan Sherrington (1984) mendapatkan bahwa antara 2,4-D dan air kelapa terjadi reaksi sinergistik yang memacu pertumbuhan kalus Daucus carota. Tetapi tidak semua auksin dan air kelapa mempunyai kerja sama yang sinergis (Gunawan, 1988). Burnet and Braham (1973) dalam George and Sherrington (1995) menemukan bahwa air kelapa 20 % akan menginisiasi pertumbuhan kalus dari
13 beberapa jenis jeruk dalam media MS. Ragavan (1974) dalam George and Sherrington (1995), telah mencoba meningkatkan pertumbuhan dari Panicum miliaceum da-lam media MS dengan menggunakan 2,4-D dalam kehadiran 15 % air kelapa.