IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Isolat Actinomycetes Amilolitik Terpilih 1. Isolat Actinomycetes Terpilih Peremajaan isolat actinomycetes dilakukan dengan tujuan sebagai pemeliharaan isolat actinomycetes agar nantinya dapat terus digunakan sampai pada akhir penelitian dan menjaga kelangsungan hidup isolat actinomycetes itu sendiri. Biasanya peremajaan actinomycetes ini dilakukan 3-4minggu sekali setelah dilihat pada sumber-sumber nutrien makanan bagi pertumbuhan actinomycetes tersebut akan mulai habis digunakan. Isolat yang digunakan pada proses peremajaan isolat actinomyetes ini didapatkan dari penelitian sebelumnya, yaitu isolat ANLd-2b-3, ANL-14 dan ANL-12 (Lina, 2009). Dipilihnya ketiga isolat actinomycetes tersebut berdasarkan pertumbuhan yang lebih baik karena tidak adanya kontaminan dibandingkan dengan isolat-isolat actinomycetes yang ada. Pertumbuhan isolat actinomycetes yang sempurna baru dapat terlihat selama 7 hari. Biakan ketiga isolat actinomycetes pada media ISP-2 disajikan pada Gambar 9.
35 ANLd-2b-3 ANL-12 ANL-4 Gambar 9. Isolat Actinomycetes Isolat actinomycetes ANLd-2b-3 mempunyai warna keabu-abuan, isolat actinomycetes ANL-12 mempunyai warna kuning keabuan dan isolat actinomycetes ANL-4 mempunyai warna kuning kecoklatan. Sedangkan bentuk dari ketiga isolat diatas mempunyai bentuk yang hampir sama yaitu ketiganya memiliki hifa atau percabangan, berbubuk, tebal, dan pertumbuhannya lebih lama di bandingkan bakteri, oleh sebab itu pertumbuhan isolat actinomycetes ini umumnya muncul dengan perlahan antara 7-10 hari baru dapat terlihat bentuk isolatnya. 2. Aktivitas Amilolitik Terpilih Uji amilolitik dilakukan dengan tujuan memilih salah satu isolat actinomycetes dari ketiga isolat actinomycetes yang ada, yang kemudian akan digunakan sebagai sumber enzim amilase yang akan dihasilkan, dengan cara melihat isolat actinomycetes mana yang mempunyai aktivitas enzim amilase paling besar. Pengujiannya dilakukan dengan melihat besarnya zona bening yang terbentuk setelah dilarutkan dengan larutan iodin.
36 Amilase merupakan enzim yang mampu menghidrolisis molekul amilum menjadi glukosa atau oligosakarida. Dengan indikator larutan Iodin tersebut akan memberikan warna bening yang menandakan bahwa isolat actinomycetes dapat menghidrolisis amilum. Ketiga isolat menunjukkan hasil yang positif dengan larutan iodin yang membentuk zona bening. Daerah zona bening tersebut adalah daerah hasil hidrolisis amilum. Kemudian ketiga isolat itu dihitung indeks amilolitiknya. Indeks amilolitik diartikan sebagai hasil bagi diameter zona bening dengan diameter koloni. Dari hasil yang telah dilakukan pada ketiga isolat actinomycetes maka diperoleh gambar hasil zona bening dan data indeks amilolitiknya, seperti disajikan pada Gambar 10 dan Tabel 1. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat ANLd-2b-3 mempunyai kemampuan amilolitik yang lebih besar dibandingkan dua isolat lainnya. ANLd-2b-3 ANL-12 ANL-4 Gambar 10. Hasil Uji Amilolitik pada actinomycetes Tabel 1. Indeks Amilolitik dari berbagai isolat actinomycetes Nama Isolat Diameter Koloni (cm) Diameter Zona Bening (cm) Indeks Amilolitik
37 ANLd-2b-3 1,7 2,6 1,529 ANL-12 1,4 2,0 1,428 ANL-4 1,6 1,8 1,128 B. Kondisi waktu dan ph optimum pertumbuhan Actinomycetes. Penentuan kondisi optimum pertumbuhan actinomycetes perlu dilakukan untuk mengetahui lingkungan optimum pertumbuhan actinomycetes dan mendapatkan kondisi terbaik dalam memproduksi enzim. Diharapkan enzim yang diproduksi akan lebih maksimal atau mempunyai aktivitas enzim yang tinggi. Proses ini dilakukan sebelum proses isolasi enzim. Pada proses penentuan kondisi optimum pertumbuhan actinomycetes isolat ANLd-2b-3 didapatkan ph optimum dan waktu optimumnya yaitu pada ph 7 dan waktu 120 jam. Sedangkan dari hasil penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Bruhlmann, et al didapatkan ph dan waktu inkubasi optimum actinomycetes yaitu pada ph 7,3 dan waktu 4 hari (96 jam). Berikut merupakan kurva pertumbuhan actinomycetes dapat dilihat pada Gambar 11 (dari data pada Tabel 3 dan 4, Lampiran 1).
38 0.18 1.5 OD Sel 0.12 0.06 1 0.5 Aktivitas Unit (U/mL) 0 0 72 144 216 Waktu (Jam) 0 OD Sel Aktivitas Unit (U/mL) Gambar 11. Hubungan antara jumlah sel (OD 600 ) dan aktivitas unit amilase dengan lama waktu fermentasi Dari Gambar 11 dapat dilihat fase eksponensial pertumbuhan actinomycetes tercapai pada waktu inkubasi 96 jam. Produksi enzim amilase dengan aktivitas tertinggi pada waktu inkubasi 120 jam, atau pada awal fase stasioner pertumbuhan actinomycetes. Setelah didapatkan waktu pertumbuhan optimum actinomycetes dalam menghasilkan enzim amilase dengan aktivitas tertinggi, kemudian ditentukan ph optimum pertumbuhan actinomycetes. Hasil pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 600nm menggunakan metode densitas optikal (OD 600 ) didapatkan ph optimum pada ph 7 dengan absorbansi sebesar OD 600 = 0,165. Kurva kondisi optimum actinomycetes pada variasi ph dapat dilihat pada Gambar 12 (dari data Tabel 5, Lampiran 1).
39 OD Sel 0.2 0.15 0.1 0.05 0 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 ph Gambar 12. Hubungan antara jumlah sel (OD 600 ) dengan ph pada saat fermentasi C. Inokulum dan Enzim Amilase Hasil Produksi Penyiapan inokulum atau media starter ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan enzim yang diproduksi lebih banyak dan maksimal. Media starter atau inokulum diinkubasi selama waktu inkubasi pertumbuhan optimum dan ph optimum, yaitu waktu inkubasi selama 120 jam dengan ph 7. D. Aktivitas Enzim Amilase Hasil Isolasi Setelah actinomycetes diinkubasi selama 120 jam dengan ph 7 dalam media fermentasi, setelah itu dilakukan pemisahan enzim amilase dari konstituen seluler lainnya sehingga diperoleh ekstrak kasar enzim. Proses isolasi enzim dilakukan dengan mensentrifugasi media fermentasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 30 menit. Pada proses isolasi ini diperoleh ekstrak kasar enzim sebanyak 469 ml dari 500 ml media fermentasi, dengan aktivitas unit 1,4 U/mL, kadar protein 0,26 mg/ml, dan aktivitas spesifik 5,4 U/mg. E. Enzim Amilase Hasil Pemurnian
40 1. Hasil Fraksinasi dengan Amonium Sulfat Proses fraksinasi dengan penambahan garam ammonium sulfat kedalam larutan enzim akan menyebabkan menurunnya kelarutan enzim tersebut, sehingga terbentuk endapan protein. Dengan adanya penambahan garam, kelarutan protein akan meningkat hal ini dikarenakan karena pada konsentrasi garam yang tinggi, garam akan lebih cenderung mengikat air dan menyebabkan agregasi Sehingga molekul protein mengalami pengendapan. Peristiwa ini disebut salting out. Proses fraksinasi ini dilakukan pada suhu 0-4 o C, hal ini betujuan agar kemungkinan hilangnya aktivitas enzim oleh adanya denaturasi dapat diminimalkan. Pemurnian enzim pada tahap pertama ini dilakukan dengan menambahkan garam amonium sulfat dalam 5 tingkat fraksi kejenuhan Fraksi kejenuhan amonium sulfat yang digunakan pada penelitian ini adalah (0-20)%, (20-40)%, (40-60)%, (60-80)%, dan (80-100)% jenuh. Pada tahapan pemurnian ini tidak dilakukan uji aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas spesifiknya tetapi pengujiannya dilakukan setelah tahap dialisis. Hal ini dilakukan agar garam yang ada dalam larutan enzim dapat terpisah terlebih dahulu, sehingga garam yang digunakan untuk mengendapkan protein tidak mempengaruhi pengukuran aktivitas enzim amilasenya, yang menyebabkan aktivitas unit enzim amilase menurun. 2. Aktivitas Dialisis Terpilih Proses pemurnian dialisis dilakukan karena adanya molekul garam dari hasil fraksinasi yang dapat mempengaruhi aktivitas dan kestabilan enzim. Oleh karena itu, dengan dilakukan tahapan pemurnian dialisis dapat mengeluarkan ion pengganggu (garam) tersebut
41 agar didapatkan enzim dengan aktivitas lebih tinggi dan kemurnian meningkat. Tahapan dialisis ini dilakukan pada kondisi dingin untuk mencegah terjadinya kerusakan protein enzim yang dimurnikan dan juga dilakukan dengan menggunakan membran berdasarkan difusi partikel zat terlarut yang menyebabkan protein enzim akan terpisah dari ion-ion garamnya dan membran yang digunakan adalah kantung selofan (Reed et al, 1998). Pada setiap pergantian buffer phospat yang dilakukan setiap 4 jam sekali, dilakukan pengujian dengan cara meneteskan larutan Ba(OH) 2 0,1M pada buffer untuk mengetahui masih ada tidaknya garam ammonium sulfat pada enzim. Jika pada larutan buffer tersebut tidak terdapat endapan putih setelah ditetesi larutan Ba(OH) 2, maka tahap dialisis telah selesai. Gambar 13 (Lampiran 2, Tabel 6) menunjukan hubungan antara fraksi enzim pada berbagai tingkat kejenuhan amonium sulfat setelah didialisis dengan aktivitas unit enzim amilase. Aktivitas Unit (U/mL) 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 (0-20)% (20-40)% (40-60)% (60-80)% (80-100)% Fraksi Dialisis Gambar 13. Kurva aktivitas amilolitik setelah fraksinasi amonium sulfat dan dialisis
42 Pada Gambar diatas dapat dilihat enzim amilase yang memiliki aktivitas unit tertinggi yaitu pada fraksi (40-60)% sebesar 2.6 U/mL. Pada fraksi-fraksi sesudah fraksi (40-60)%, masih terlihat tinggi aktivitas enzimnya, yang menandakan bahwa amonium sulfat masih dapat mengendapkan protein enzim pada fraksi-fraksi tersebut. Aktivitas unit tiap fraksi berbeda karena dipengaruhi oleh tinkat kejenuhan garam amonim sulfat yang semakin meningkat. Berikut adalah Tabel Pemurnian enzim amilase dari actinomycetes pada berbagai tahap pemurnian. Dapat dilihat bahwa pada Tabel di bawah ini terjadi peningkatan aktivitas dan tingkat kemurnian enzim amilase pada tahap pemurnian dialisis dari fraksi (40-60) % dibandingkan dengan ekstrak kasar. Tabel 2. Hasil Pemurnian Enzim Amilase Volume Aktivitas Aktivitas Kadar Aktivitas Tingkat Tahap Enzim Unit Total Protein Spesifik kemurnian Perolehan (%) (ml) (U/mL) (U) (mg/ml) (U/mg) (kali) Ektrak Kasar 500 1.4 697 0.26 5.4 1 100 Fraksi (40-60)% Setelah Dialisis 23.5 2.6 60.8 0.35 7.4 1.37 10 Hasil dialisis menunjukan aktivitas enzim yang meningkat dengan tingkat kemurnian yang lebih tinggi yaitu 1,37 kali lebih murni dibandingkan ekstrak kasar dan dengan perolehan 10 %. F. Enzim Amilase Hasil Karakterisasi
43 Pada proses karakterisasi enzim ini dilakukan agar dapat diaplikasikan pada kebutuhan industri terhadap enzim yang semakin meningkat dan bervariasi yang menuntut adanya upaya peningkatan produksi jumlah enzim. 1. Suhu Optimum Enzim Amilase Aktivitas tertinggi (U/mL) enzim hasil pemurnian dari actinomycetes dapat dilihat pada Gambar 14. Suhu optimum enzim amilase berdasarkan Gambar 14 adalah 50 0 C (dari data tabel 7, Lampiran 2 ). Aktivitas Unit (U/mL) 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 20 30 40 50 60 70 80 90 Suhu ( o C) Gambar 14. Penentuan suhu optimum enzim amilase Pada Gambar di atas, aktivitas enzim semakin meningkat seiring dengan kenaikan suhu sampai pada suhu optimum. Setelah mencapai aktivitas maksimum pada suhu optimum, aktivitas enzim akan menurun seiring dengan kenaikan suhu. Pada suhu kurang dari 50 o C kestabilan enzim cukup tinggi namun kemampuan hidrolisis pati oleh enzim tidak berjalan secara maksimal. Dengan meningkatnya temperatur (suhu) akan menyebabkan meningkatnya energi kinetik yang akan mempercepat gerak vibrasi, translasi, serta gerak
44 rotasi dari enzim sehingga peluang enzim dan substrat untuk bertumbukan dan bereaksi meningkat, dan produk yang dihasilkan akan semakin bertambah pula. Akan tetapi diatas temperatur optimum, aktivitas enzim menurun tajam. Hal ini terjadi karena enzim mulai mengalami perubahan konformasi yang menyebabkan sisi aktifnya tidak sesuai lagi dengan substrat. Hal ini dikarenakan gugus reaktifnya mengalami hambatan untuk memasuki sisi aktif enzim sehingga struktur enzim akan mengalami kerusakan dan aktivitas enzim semakin menurun (Suhartono, 1989). 2. ph Optimum Enzim Amilase Aktivitas optimum amilase dicapai pada ph 7, hal ini disebabkan karena pada kondisi ph 7, gugus pemberi atau penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada pada tingkat yang diinginkan sehingga aktivitas katalitiknya tinggi dan karena terjadinya perubahan ionisasi pada gugus ionik sisi enzim tersebut yang mempengaruhi sisi aktifnya, maka hal ini menyebabkan enzim dapat mengikat substrat lebih efektif dan mengubahnya menjadi produk. Dibawah ph optimum, ion H + akan berikatan dengan gugus NH - 2 bebas membentuk NH + 3, sehingga ikatan hidrogen dari amina (NH 2 ) dengan gugus karbonil dalam molekul protein enzim akan putus dan menyebabkan perubahan konformasi pada pusat aktif enzim. Sedangkan diatas ph optimum, ion OH - akan berikatan dengan atom hidrogen dari molekul enzim membentuk H 2 O, sehingga ikatan hidrogen yang ada dalam molekul protein enzim akan putus. Jika ph semakin jauh dari ph optimum, akan menyebabkan enzim
45 mengalami penurunan aktivitas hingga laju reaksi mencapai nol. Laju reaksi akan menurun dikarenakan perubahan gugus yang bermuatan akan menyebabkan perubahan konformasi lipatan pada enzim sehingga konformasi sisi aktif enzim ikut terpengaruh akibatnya aktivitas enzim akan menurun dengan adanya perubahan konformasi dari sisi aktif enzim. Hal ini juga disebabkan karena telah berkurangnya komponen didalam medium yang menjadi penginduksi sintesis enzim atau substrat (Abianto, 1989). Aktivitas Unit (U/mL) 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 ph Gambar 15. Penentuan ph optimum enzim amilase Aktivitas unit amilase (U/mL) optimum hasil pemurnian dari actinomycetes adalah pada ph 7 (Tabel 8, lampiran 2) dapat dilihat pada Gambar 15. 3. Waktu Optimum Enzim Amilase Aktivitas tertinggi (U/mL) enzim hasil pemurnian dari actinomycetes dapat dilihat pada Gambar 16. Waktu optimum enzim amilase berdasarkan Gambar 16 adalah 30 menit (dari data Tabel 9, Lampiran 3).
46 Aktivitas Unit (U/mL) 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Waktu (menit) Gambar 16. Penentuan waktu inkubasi optimum enzim amilase Pada Gambar di atas, aktivitas enzim semakin meningkat seiring dengan bertambahnya waktu inkubasi sampai pada waktu optimum. Setelah mencapai aktivitas maksimum pada waktu optimum, aktivitas enzim akan menurun seiring dengan bertambahnya waktu inkubasi. Hal ini dapat disebabkan adanya perbedaan waktu yang dibutuhkan oleh setiap enzim untuk bereaksi dengan substrat. Namun ada saatnya jumlah produk menjadi konstan sementara waktu terus meningkat, yang biasa dikenal sebagai istilah turunnya laju reaksi (product over time). Hal ini disebabkan karena jumlah substrat yang berkurang ataupun hasil dari reaksi enzim atau produk menghambat pembentukkan dari kompleks enezim substrat sehingga aktivitas enzim akan semakin menurun nilainya. 4. K M dan V maks Enzim Hasil Pemurnian. Kecepatan reaksi enzim akan meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat sampai pada suatu harga yang memberikan kecepatan reaksi tetap. Pada keadaan tersebut, kecepatan reaksi enzim mencapai maksimum karena reaksi enzim dengan substratnya
47 menjadi lebih jenuh dan tidak dapat bereaksi lebih cepat. Harga K M dari suatu enzim berfungsi untuk mengetahui konsentrasi dari subsrat yang menghasilkan laju reaksi maksimum. Grafik Penentuan harga K M dan V maks enzim amilase dapat dilihat pada Gambar 17. y = 0.103x + 0.0327 1/[V] (ml/u) 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0-0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 1/[S] (ml/mg) Gambar 17. Grafik Lienweaver-Burk enzim amilase Berdasarkan data pada Gambar tersebut, laju reaksi meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat. Jika konsentrasi substrat terus dinaikan, akan ada suatu saat enzim jenuh dengan substratnya sehingga peningkatan konsentrasi substrat tidak lagi meningkatkan laju reaksi dan walaupun substrat terus mengalami penambahan, pembentukan kompleks enzim substrat tidak lagi dimungkinkan, keadaan ini disebut laju reaksi maksimum (V maks ) (Lehninger, 1982).
48 Dari persamaan Lineweaver-burk diperoleh harga V maks hasil pemurnian sebesar 30,6 μmol ml -1 menit -1, sedangkan nilai K M sebesar 3,15 mg ml -1 (dari data pada Tabel 10, Lampiran 3).
49