BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Salah satu produk kosmetik yang banyak menggunakan bahan pengawet sebagai bahan tambahan adalah krim wajah. Metode analisis yang sensitif dan akurat diperlukan untuk mengetahui keamanan bahan tambahan yang digunakan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui bahwa campuran metil paraben dapat dianalisis dengan metode spektrofotometri UV/Vis derivatif, untuk menghasilkan metode analisis yang baik dan valid serta mengetahui kadar metil paraben dan propil paraben dalam sediaan krim sesuai dengan ketentuan dari Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM). 4.1 Spektrum Derivatif Metil Paraben dan Propil Paraben Preparasi sampel dilakukan dengan melarutkan sampel krim kosmetika dengan larutan HCl 0,1 M. Hasil larutan uji berwarna putih bening. Ketiga jenis sampel memiliki warna yang terlihat sama setelah mengalami penyaringan. Penyaringan ini dilakukan untuk mencegah adanya partikel-partikel terutama lemak yang masih terdapat dalam sampel agar tidak mengganggu pembacaan absorbansi. Selanjutnya adalah melakukan tahapan mencari spektrum derivatif. Langkah derivatif spektrum dilakukan dengan cara membaca panjang gelombang dari metil paraben dan propil paraben. Didapatkan panjang gelombang 255,4 nm untuk metil paraben dan 255,6 nm untuk propil paraben. Spektrum panjang gelombang maksimum metil paraben dapat dilihat pada gambar 4.1. serta spektrum panjang gelombang maksimum propil paraben dapat dilihat pada gambar 4.2. 25
26 Gambar 4.1. Spektrum panjang gelombang maksimum metil paraben 255,4 nm Gambar 4.2. Spektrum panjang gelombang maksimum propil paraben 255,6 nm Kemudian spektrum dari masing-masing panjang gelombang metil paraben dan propil paraben diderivatif menggunakan sistem perangkat lunak pada komputer. Hasil
27 panjang gelombang derivatif yang diperoleh untuk metil paraben 242,4 nm sedangkan untuk propil paraben 242,6 nm, karena spektrum pada panjang gelombang tersebut menghasilkan kemiringan nol pada puncak maksimum dan memperlihatkan maksimum dan minimum. Spektrum panjang gelombang maksimum derivatif metil paraben dan propil paraben dapat dilihat pada gambar 4.3. dan 4.4. Gambar 4.3. Spektrum panjang gelombang maksimum derivatif metil paraben 242,4 nm Gambar 4.4. Spektrum panjang gelombang maksimum derivatif propil paraben 242,6 nm
28 Spektrum derivatif digunakan untuk menjelaskan pita-pita serapan dalam spektrum UV yang lebih kompleks (8). Fungsi lain adalah untuk memberikan gambaran struktur yang terinci dari spektrum serapan sehingga dapat digunakan untuk analisis campuran beberapa zat secara langsung tanpa harus melakukan pemisahan terlebih dahulu walaupun dengan panjang gelombang yang berdekatan (20). 4.2 Validasi Metode Metode Spektrofotometri UV/Vis Validasi metode analisis merupakan penilaian terhadap metode tertentu secara laboratorium untuk membuktikan bahwa metode tersebut memenuhi persyaratan yang ditentukan dalam penggunaan nya (21). Validasi diperuntukkan untuk metode analisa yang baru dibuat dan dikembangkan sehingga didapatkan hasil yang valid. Validasi metode perlu dilakukan dalam penelitian ini karena metode ini merupakan pengembangan dari metode sebelumnya. Metode sebelumnya menggunakan pelarut methanol:air dan alat yang digunakan adalah spektrofotometri UV/Vis double beam Shimadzu UV-1700 Pharma. Pengembangan metode dilakukan dengan penggantian pelarut menjadi 0,1 M HCl dan alat yang digunakan spektrofotometri UV/Vis double beam Shimadzu UV-1800, sehingga parameter yang diuji memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Parameter validasi yang digunakan dalam metode analisis tergantung dari kategori percobaan yang dilakukan.. Metode yang dilakukan merupakan kategori I karena metil paraben dan propil paraben merupakan bahan pengawet, sehingga parameter-parameter yang diuji antara lain linieritas, Limit of Detection (LoD), Limit of Quantitation (LoQ), presisi dan akurasi. 4.2.1 Linieritas Linieritas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linieritas yang dapat diterima (21).
29 Linieritas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit (21). Nilai r yang direkomendasikan oleh Association of Official Analytical Chemist (AOAC) adalah 0,99. Berdasarkan kurva baku, metil paraben pada panjang gelombang 242,4 nm pada level konsentrasi 1,0; 2,0 ;3,0 ;4,0 ;5,0 ppm diperoleh persamaan regresi linear y=0,0423x+0,2855 r = 0,999 dan kurva baku metilpraben pada panjang gelombang 242,6 nm pada level konsentrasi 1,0 ;2,0 ;3,0 ;4,0 ;5,0 ppm diperoleh persamaan regresi linear y= 0,0428+0,3102, nilai r = 0,999. Sedangkan kurva baku propil paraben pada panjang gelombang 242,4 nm dengan level konsentrasi 20; 30; 40; 50; 60 ppm diperoleh persamaan regresi linear y = 0,0102x+0,0396, nilai r = 0,999 dan kurva baku propil paraben pada panjang gelombang 242,6 nm dengan level konsentrasi 20; 30; 40; 50; 60 ppm diperoleh persamaan regresi linear y = 0,0104x + 0,0644, nilai r = 0,999. Nilai koefisien korelasi yang diperoleh menunjukan hasil yang baik karena r >0,99. Hal ini menunjukan bahwa antara respon analitik dengan konsentrasi yang diukur perbandingannya proporsional. Kurva kalibrasi metil paraben derivatif dengan panjang gelombang 242,4 nm dan 242,6 nm dapat dilihat pada gambar 4.5. Sedangkan kurva kalibrasi propil paraben derivatif dengan panjang gelombang 242,4 nm dan 242,6 nm dapat dilihat pada gambar 4.6.
30 A b s o r b a n s i 0,52 0,47 0,42 0,37 0,32 y = 0,0428x + 0,3102 r = 0,9994 y = 0,0423x + 0,2855 r = 0,9995 0 2 4 6 Konsentrasi absorbansi metil paraben derivatif pada 242,60 absorbansi metil paraben derivatif pada 242,40 Gambar 4.5. Regresi liniear metil paraben derivatif 242,4 nm dan 242,6 nm A b s o r b a n s i 0,72 0,62 0,52 0,42 0,32 y = 0,0104x + 0,0644 r = 0,999 y = 0,0102x + 0,0396 r = 0,9991 0,22 10 30 50 70 Konsentrasi absorbansi propil paraben derivatif pada 242,6 absorbansi propil paraben derivatif pada 242,4 Gambar 4.6. Regresi liniear propil paraben derivatif 242,4 nm dan 242,6 nm 4.2.2 Penentuan batas deteksi (Limit of Detection, LOD) dan batas kuantitasi (Limit of Quantitation, LOQ) Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu (18). Sedangkan batas kuantifikasi didefinisikan sebagai
31 konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan (18). Tabel 4.1. Nilai LOD - LOQ derivatif metil paraben dan propil paraben No Senyawa Panjang gelombang LOD LOQ 1 Metil paraben 2 Propil paraben 242,4 0,13 0,39 242,6 0,15 0,44 242,4 1,78 5,39 242,6 2,08 6,31 4.2.3 Presisi Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analis yang diekspresikan sebagai simpangan baku ralatif (RSD) (18). Pada penelitian ini pengujian presisi dilakukan secara repeatability (keterulangan). Keterulangan adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek (21). metil paraben yang dipilih adalah 3 ppm dan propil paraben 40 ppm untuk mewakili kisaran sampel yang dianalisis dengan jumlah sebanyak enam kali. Nilai presisi metil paraben dan propil paraben yang diperoleh dapat dilihat pada tabel 4.2. dan 4.3. Berdasarkan tabel 4.2 dan 4.3. nilai RSD metil paraben dan propil paraben pada kadar 3 ppm dan 40 ppm menghasilkan nilai yang baik. Menurut Association of Official Chemist (AOAC) dengan kadar 1,0-10 ppm nilai RSD yang memenuhi syarat adalah kurang dari 6%, dan pada konsentrasi 10-100 ppm < 8% ( (22).
32 Tabel 4.2. Nilai presisi kadar metil paraben pada panjang gelombang 242,4 nm dan 242,6 nm Metil paraben 242,4 nm 242,6 nm Replikasi Replikasi 1 2,97 1 2,98 2 3,01 2 3,01 3 3,25 3 3,24 4 3,25 4 3,24 5 3,23 5 3,22 6 3,20 6 3,20 Rata-Rata 3,15 Rata-Rata 3,15 SD 0,13 SD 0,12 RSD 4,04 RSD 3,78 Keterangan : SD : Standar Deviasi ; RSD: Standar Deviasi Relatif *Persyaratan RSD menurut AOAC konsentrasi 1,0-10 ppm : < 6% ; Konsentrasi 10-100 ppm : < 8% (22). Tabel 4.3 Nilai presisi kadar propil paraben pada panjang gelombang 242,4 nm dan 242,6 nm Propil paraben 242,4 nm 242,6 nm Replikasi Replikasi 1 39,84 1 39,48 2 39,94 2 39,57 3 40,04 3 39,67 4 40,14 4 39,86 5 40,14 5 39,77 6 40,23 6 39,86
33 Rata-Rata 40,05 Rata-Rata 39,70 SD 0,14 SD 0,15 RSD (%) 0,36 % RSD 0,39 % Keterangan : SD : Standar Deviasi ; RSD: Standar Deviasi Relatif *Persyaratan RSD menurut AOAC konsentrasi 1,0-10 ppm : < 6% ; Konsentrasi 10-100 ppm : < 8% (22). 4.2.4 Akurasi Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya dalam suatu pengukuran kuantitas. (23) Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan (21). Pada penelitian ini akurasi ditentuan dengan metode penambahan baku (standard addition method) dengan menggunakan tiga macam konsentrasi standar metil paraben dan propil paraben yang akan ditambahkan kedalam sampel, yaitu konsentrasi 80%, 100%, 120% dari kadar analit dalam sampel. Hasil persen recovery dapat dilihat pada tabel 4.4, 4.5, 4.6 dan 4.7. Berdasarkan tabel 4.4 dan 4.5, nilai persen recovery metil paraben pada panjang gelombang 242,4 nm adalah 93,58 % -118,86 % dan pada panjang gelombang 242,6 nm adalah 82,75% - 112,93%. Sedangkan propil paraben pada panjang gelombang 242,4 nm diperoleh nilai persen recovery 83,33% - 102,29% dan pada panjang gelombang 242,6 nm adalah 84,61-102,29%. Nilai yang diperoleh ini memenuhi kriteria nilai persen recovery yang dapat di terima berdasarkan criteria AOAC, yakni untuk kadar 1-10 ppm nilai persen recovery yang baik adalah 75-120%, dan untuk kadar 10-100 ppm adalah 80-115% sehingga metode yang digunakan memiliki akurasi yang baik.
34 Akurasi Tabel 4.4. Nilai akurasi metil paraben pada 242,4 nm Replikasi sampel+standar sampel standar Persen Recovery Rata-rata persen recovery 80% R1 1,90 91,61 R2 1,93 0,44 1,6 93,08 93,58 R3 1,97 96,04 100% R1 2,37 96,93 R2 2,40 0,44 2 98,11 97,71 R3 2,40 98,11 120% R1 3,27 118,20 R2 3,30 0,44 2,4 119,19 118,86 R3 3,29 119,19 *Persyaratan nilai akurasi kadar 1-10 ppm menurut AOAC adalah 75-120% (22). untuk kadar 10-100 ppm adalah 80-115% (22). Keterangan: R1 : Replikasi 1 R2 : Replikasi 2 R3 : Replikasi 3 Akurasi Replikasi Tabel 4.5. Nilai akurasi metil paraben pada 242,6 nm sampel+standar sampel standar Persen Recovery Rata-rata persen recovery 80% R1 2,24 84,70 R2 2,22 0,88 1,6 83,24 82,75 R3 2,17 80,31 100% R1 2,82 96,96 R2 2,87 0,88 2 99,23 98,52 R3 2,87 99,23 120% R1 3,57 2,4 111,95 R2 3,59 0,88 112,93 112,93 R3 3,62 113,90 *Persyaratan nilai akurasi kadar 1-10 ppm menurut AOAC adalah 75-120% (22). untuk kadar 10-100 ppm adalah 80-115% (22). Keterangan: R1 : Replikasi 1 R2 : Replikasi 2 R3 : Replikasi 3
35 Akurasi Tabel 4.6. Nilai Akurasi Propil paraben pada 242,4 nm Replikasi sampel+standar sampel standar Persen Recovery (%) Rata-rata persen recovery(%) R1 42,78 84,31 80% R2 42,69 25,92 20 83,82 83,33 R3 42,29 81,86 R1 48,27 89,41 100% R2 48,27 25,92 25 89,41 89,54 R3 48,37 89,80 R1 56,71 102,61 120% R2 56,80 25,92 30 102,94 102,29 R3 56,31 101,31 *Persyaratan nilai akurasi kadar 1-10 ppm menurut AOAC adalah 75-120% (22). untuk kadar 10-100 ppm adalah 80-115% (22). Keterangan: R1 : Replikasi 1 R2 : Replikasi 2 R3 : Replikasi 3 Akurasi Tabel 4.7. Nilai akurasi Propil paraben pada 242,6 nm Replikasi sampel+standar sampel standar Persen Recovery (%) Rata-rata persen recovery (%) R1 44,29 85,10 80% R2 43,94 27,27 20 83,17 84,61 R3 44,38 85,58 R1 51,11 95,38 100% R2 51,50 27,27 25 96,92 95,51 R3 50,83 94,23 R1 57,56 100,96 120% R2 57,85 27,27 30 101,92 101,82 R3 58,04 102,56 *Persyaratan nilai akurasi kadar 1-10 ppm menurut AOAC adalah 75-120% (22). untuk kadar 10-100 ppm adalah 80-115% (22). Keterangan: R1 : Replikasi 1 R2 : Replikasi 2 R3 : Replikasi 3 4.3 Penetapan Sampel Preparasi sampel untuk penetapan kadar mengacu pada Popovic, G., et al, J. Pharm. Biomed Anal, 33 (2003) dengan adanya penambahan larutan HCl 0,1 M yang berfungsi untuk melarutkan senyawa dalam sampel (10). Sampel yang
36 digunakan pada penelitian ini adalah kosmetik krim wajah yang tidak memiliki nomor registrasi. Analisis penetapan kadar metil paraben dan propil paraben dilakukan dengan metode spektrofotometri UV/Vis derivatif. Langkah pertama yang dilakukan adalah optimasi panjang gelombang yang bertujuan untuk menentukan panjang gelombang maksimum yang akan digunakan dalam pengukuran kadar metil paraben dan propil paraben. Hasil yang panjang gelombang maksimum yang diperoleh adalah 242,4 nm dan 242,6 nm. Penetapan kadar dilakukan setelah metode yang akan digunakan telah valid. Hasil penetapan kadar tertera pada tabel 4.8. Berdasarkan hasil yang ditampilkan pada tabel 4.8., kadar pengawet yang terkandung dalam sampel untuk metil paraben sebesar 6,015 x10-4 % sedangkan propil paraben 0,025%. yang diperoleh ini tidak melebihi batas penggunaan maksimum yang ditetapkan oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) yaitu 0,4 % untuk paraben tunggal, sedangkan untuk paraben gabungan tidak melebihi kadar 0,8% (17). Hal ini menunjukkan bahwa sampel yang diteliti aman untuk digunakan. Tabel 4.8. Nilai kadar metil paraben dan propil paraben Nama Sampel Replikasi Metil Paraben (% b/b) Propil Paraben Sampel A Sampel B Sampel C R1 5,654x10-4 0,028 R2 0,0013 0,015 R1 6,847x10-4 0,027 R2 6,815x10-4 0,026 R1 2,265x10-4 0,026 R2 1,551x10-4 0,028 Rata-rata 6,015 x10-4 0,02 *persyaratan batas aman penggunaan metil paraben dan propil paraben adalah tidak lebih dari 0,4 % b/b (17).
37 4.4 Keterbatasan penelitian Penelitian ini memiliki keterbatasan, karena tidak melakukan optimasi ekstrak sampel krim terlebih dahulu untuk memisahkan metil paraben dan propil paraben dari lapisan lemak. Parameter validasi metode yang dilakukan hanya linieritas, presisi, akurasi, batas deteksi (LOD), batas kuantifikasi (LOQ).