20 EFFECTIVENESS OF RAPD AND SSR MARKERS FOR GENETIC ANALYSIS OF NINE PISIFERA OIL PALM (Elaeis guineensis Jacq.) ORIGINATED FROM NIGERIA Abstract The objectives of this experiment were to compare effectiveness of RAPD and SSR markers for genetic analysis of nine pisifera oil palm originated from Nigeria (pisifera Nigeria). Nine accessions of pisifera Nigeria (5 accessions of TxP pisifera family and 5 accessions of pisifera clone) were used. Five random primers were used to generated RAPD markers and five specific primers were used for SSR markers. Results of the experiment indicated four out of five evaluated random primers generated polymorphic RAPD markers in the pisifera Nigeria. All primers generated a total of 16 RAPD markers and only four of them (25%) were polymorphic in the pisifera Nigeria. The average number of generated RAPD markers was 3.2 markers per primer while the average number of polymorphic marker per primer was only 0.8. Results also indicated all specific primers (100%) generated polymorphic SSR markers in the pisifera Nigeria. The average number was 2.6 alleles per primer while the average number of polymorphic alleles per primer was 1,0. Either RAPD or SSR markers was able to indicate the identity of four ramets of pisifera clone as single genotype, indicating they were clonal materials. On the other hand, either RAPD or SSR marker correctly identified the TxP pisifera accessions as genetically different, indicating they were segregants or recombinants. The result of UPGMA analysis using RAPD marker positioned the pisifera clone at 0.83 0.91 similarity to accession of TxP pisifera family while using SSR marker they were at 0.63 0.84. This data indicated that SSR was more informatic than RAPD marker. In addition SSR marker was codominant, more polymorphic, easier to interpret and showed higher reproducibility than RAPD marker. Therefore, SSR marker was suggested for oil palm genetic diversity studies. Key words : Molecular marker, pisifera TxP family, pisifera clone, polymorphism, UPGMA.
21 Pendahuluan Kelapa sawit tipe pisifera merupakan tetua jantan penghasil serbuk sari yang berperan penting dalam membentuk turunan yang unggul dan berkualitas. Pisifera Nigeria yang dikoleksi oleh PT Bina Sawit Makmur dihasilkan secara generatif melalui persilangan tenera (GHA 608) x pisifera (GHA 608). Dari persilangan ini menghasilkan pohon tipe pisifera sebesar 50% dari populasi bibit hasil persilangan. Sebagian pisifera Nigeria milik PT Bina Sawit Makmur juga berasal dari perbanyakan vegetative melalui teknik kultur jaringan yang melibatkan tetua pisifera GHA 608 sebagai sumber eksplan (ortet). Dari kultur jaringan ini menghasilkan 100% pohon pisifera (ramet) yang seragam (BSM 2007). Berdasarkan asal usulnya, pisifera hasil persilangan TxP secara genetik akan beragam sedangkan pisifera klon secara genetik seragam. Keragaman atau keseragaman masing-masing pisifera Nigeria tersebut perlu dianalisis lebih lanjut. Ada beberapa pendekatan yang dapat dilakukan untuk mengevaluasi keragaman genetik pada tanaman yaitu melalui informasi berdasarkan marka morfologi, sitologi dan molekuler. Marka berbasis protein (enzim) meskipun relatif cepat, murah dan mudah namun masih memiliki tingkat polimorfisme yang terbatas (Meunier 1992). Marka molekular berbasis DNA mampu menjadi alternatif yang lebih baik untuk mengkarakterisasi populasi tanaman karena polimorfismenya lebih tinggi, konsisten dan tidak dipengaruhi faktor lingkungan (Rafalski et al. 1994; Wickneswari 1996). Studi genetik berbasis molekuler pada tanaman kelapa sawit yang telah dilakukan diantaranya kajian genom kelapa sawit menggunakan restriction fragment length polymorphism (RFLP), random amplification of polymorphic DNA (RAPD) dan amplified fragment length polimorphism (AFLP) (Rajanaidu et al. 1995; Singh dan Cheah 1996), studi keragaman genetik 241 aksesi E. oleifera dari Amerika dan 38 aksesi E. guineensis dari Afrika menggunakan RFLP dan AFLP (Barcelos 1998), studi pembentukan peta pautan genetik dan quantitative trait loci (QTL) kelapa sawit (Asmono et al. 2002; Setiyo et al. 2001), peta pautan genetik marka RAPD dan analisis QTL
22 kelapa sawit (Irwansyah et al. 2004), karakterisasi 21 lokus marka simple sequence repeats (SSR) pada kelapa sawit (Bilotte et al. 2001) dan peta pautan genetik kelapa sawit berbasis SSR (Bilotte et al 2005). Marka SSR juga telah digunakan sebagai prosedur pengendalian mutu dalam memproduksi klon kultur jaringan kelapa sawit dalam skala komersial (Singh et al. 2007). Marka RAPD merupakan salah satu marka DNA yang menggunakan prinsip kerja polymerase chain reaction (PCR) untuk mengamplifikasi sekuen DNA tertentu secara in-vitro. Marka RAPD merupakan marka genetik yang relatif sederhana, mudah dalam penyiapannya, memberikan hasil lebih cepat dan menghasilkan marker yang relatif tidak terbatas jumlahnya sehingga sangat membantu untuk analisis keragaman genetik tanaman yang informasi tentang DNA genomnya tidak diketahui (Asmono et al. 2000). Mikrosatelit, yang juga dikenal dengan simple sequence repeats (SSR) merupakan DNA berulang yang sub unitnya terdiri atas 1-6 nukleotida. Mikrosatelit diketahui tersebar secara merata pada genom eukariot. Marka mikrosatelit merupakan marka DNA yang memiliki beberapa keunggulan, yaitu: sangat polimorfis, jumlahnya melimpah, pewarisannya bersifat kodominan, analisisnya sederhana dan mudah ditranfer melalui publikasi sekuen. Sebagai marka kodominan yang lokus spesifik, marka SSR secara luas telah digunakan sebagai alat untuk identifikasi genotipe dan kajian genetika populasi pada tanaman. (Saghai-Maroof et al., 1994; Smith et al., 1997; Bilotte et al., 2001; Singh et al., 2007). Dengan tersedianya berbagai marka yang ditunjukkan marka molekuler berbasis DNA sebagai alat bantu untuk analisis keragaman genetik tersebut selayaknya dievaluasi efektifitasnya pada berbagai tanaman yang bernilai ekonomi. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi efektifitas penggunaan marka RAPD dan marka SSR untuk analisis keragaman genetik plasma nutfah kelapa sawit pisifera Nigeria. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi awal guna mendapatkan marka yang efektif dan efisien untuk analisis keragaman genetik plasma nutfah kelapa sawit.
23 Bahan dan Metode Tempat, Waktu dan Bahan Tanaman Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Sampel daun tanaman diambil dari Kebun Induk PT Bina Sawit Makmur, Sumatera Selatan. Penelitian dilaksanakan mulai bulan November 2007 sampai dengan April 2009. Bahan tanaman yang digunakan untuk analisis keragaman genetik berupa sampel daun tanaman kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.) pisifera Nigeria famili TxP No. 24 yang terdiri atas lima nomor aksesi (320/3, 320/8, 320/9, 320/11 dan 320/12) dan pisifera klon yang terdiri atas empat ramet (2401, 2402, 2403 dan 2404). Pengambilan sampel daun mengacu pada metode yang dikembangkan oleh Toruan-Mathius et al. (1996). Isolasi DNA DNA genomik diisolasi dari jaringan daun pertama (daun tombak) kelapa sawit dilakukan mengikuti metode CTAB yang dikembangkan oleh Orozco Castillo et al. (1993). Modifikasi dengan penambahan PVP (polyvinylpyrrolidone) 50 mg dan 2-Mercaptoethanol 10 µl ke dalam larutan penyangga. Konsentrasi dan kemurnian DNA dapat ditentukan dengan UV-spektrofotometer. Tingkat kemurniaan DNA yang cukup memadai untuk analisis lanjutan sesuai yang ditetapkan Sambrook et al. (1987) adalah jika nilai absorban pada panjang gelombang (λ) 260 dan 280 nm berkisar 1,7 2,0. Keragaman genetik berdasarkan marka RAPD Protokol reaksi amplifikasi diadaptasi dari prosedur yang dikembangkan oleh William et al. (1990). Reaksi amplifikasi dilakukan dengan Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400. Untuk satu kali PCR dengan volume akhir 25 µl, ke dalam tabung PCR 0.2 ml ditambahkan reaksi 14.3 µl aquabidestilata (ddh2o) steril; 2.5 µl Taq buffer 10x; 2.5 µl MgCl 2 1.5 mm; 2.5 µl dntp 10 mm; 1.0 µl primer acak 10 pmol/µl; 0.2 µl Taq DNA polymerase 5 U/µl dan
24 2 µl DNA 25 ng/µl. Tahapan PCR diatur sebagai berikut: (1) tahapan pra-amplifikasi pada suhu 94ºC selama 2 menit; (2) tahapan amplifikasi sebanyak 45 siklus masing-masing siklus terdiri dari tiga tahapan yaitu, (a) pemisahan utas ganda cetakan DNA menjadi utas tunggal (denaturasi) pada 94ºC selama 1 menit, (b) penempelan primer pada utas tunggal DNA (primer annealing) pada 36ºC selama 1 menit dan (c) pemanjangan utas nukleotida baru (primer extension) pada 72ºC selama 2 menit; serta (3) tahapan pasca-amplifikasi yaitu pemanjangan utas tunggal DNA tahap akhir (final extention) pada 72ºC selama 4 menit dan pendinginan pada suhu ruang atau suhu simpan 4ºC. DNA hasil amplifikasi PCR yang didapat ditambahkan 2 µl loading buffer dan potongan DNA-nya dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa 1.4% (w/v) menggunakan larutan penyangga TAE 1x. Setelah elektroforesis gel agarosa diberi pewarnaan (staining) dengan merendam ke dalam larutan etidiumbromida 5 µg/l selama 30 menit dan dibilas (destaining) dengan aquades selama 20 menit. Pita DNA divisualisasikan di atas UV-transluminator (panjang gelombang 312 nm) dan didokumentasikan dengan kamera. Keragaman genetik berdasarkan marka SSR Amplifikasi DNA mengikuti metode yang dikembangkan oleh Bilotte et al. (2001) dengan menggunakan Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400. Tahapan PCR diatur sebagai berikut: (1) tahapan pra-amplifikasi pada 94ºC selama 1 menit, (2) tahapan amplifikasi sebanyak 35 siklus masing-masing siklus terdiri atas tiga tahapan yaitu (a) pemisahan utas ganda cetakan DNA menjadi utas tunggal (denaturasi) pada 94ºC selama 30 detik, (b) penempelan primer pada utas tunggal DNA (primer annealing) pada 52ºC selama 1 menit, dan (c) pemanjangan utas nukleotida baru (primer extension) pada 72ºC selama 2 menit; serta (3) tahapan pasca-amplifikasi yaitu pemanjangan utas tunggal DNA tahap akhir (final extention) pada 72ºC selama 8 menit dan pendinginan pada suhu ruang atau suhu simpan 4ºC. Untuk satu reaksi PCR dengan volume akhir 25 µl, ke dalam tabung PCR 0.2 ml ditambahkan reaksi 14.3 µl aquabidestilata (ddh2o) steril; 2.5 µl Taq buffer 10x; 2.5 µl MgCl 2 1.5 mm; 2.5 µl dntp 10 mm; 1.0 µl primer forward dan
25 reverse 10 pmol/µl; 0.2 µl Taq DNA polymerase 5 U/µl dan 2 µl DNA 50 ng/µl. Reaksi PCR dihentikan dengan penambahan 25 μl buffer formamide (0.3% bromophenol blue; 0.3% xylene cyanol; 10 mm EDTA ph 8.0; 97.5% deionized formamide). Masing-masing DNA hasil amplifikasi PCR dielektroforesis pada gel akrilamide 6% yang mengandung urea 7 M menggunakan larutan penyangga TBE 1x. Elektroforesis dilakukan pada tegangan tetap 60 W dan suhu 55 C selama 90 120 menit. Elektroforesis dihentikan bila pewarna yang lambat bergerak mencapai dua pertiga bagian gel. Selanjutnya gel akrilamid diberi pewarnaan (staining) dengan silver nitrat selama 30 hingga 60 menit mengikuti metode yang dikembangkan oleh George et al. (2004). Gel dikeringkan selama 2-3 hari lalu didokumentasi dengan menggunakan scanner. Analisis data. Profil pita DNA hasil amplifikasi PCR dengan menggunakan primer acak (marka RAPD) atau primer spesifik (marka SSR) diubah ke bentuk data biner. Data biner digunakan untuk menghasilkan matrik data biner dengan bantuan program numerical taxonomy and multivariate system (NTSYSpc) versi 2.02 (Rohlf, 1998). Dari matrik data biner diturunkan menjadi matrik kesamaan genetik (similarity matrix) antar sawit menggunakan koefiesien Dice (Dice 1945; Nei dan Li 1979). Matrik kesamaan genetik ini dibuat menggunakan similarity for quantitative data (SIMQUAL) yang merupakan sub-program similarity and dissimilarity. Berdasarkan nilai matrik kesamaan genetik yang didapat tersebut dilakukan analisis pengelompokan (Cluster Analysis) menggunakan metode unweighted pair-group method with aritmathic average (UPGMA). Analisis pengelompokan ini dilakukan dengan sub-program sequential agglomerative hierarical nested cluster analysis (SAHN). Hasil analisis pengelompokan UPGMA menggunakan tree-display yang merupakan sub-program Graphics Program NTSYSpc (Zulkifli et al. 2001). Dendogram yang diperoleh mencerminkan hubungan kesamaan genetik antar individu kelapa sawit yang dievaluasi.
26 Hasil dan Pembahasan Seleksi Primer Acak RAPD Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari 5 primer acak RAPD yang digunakan untuk menganalisis aksesi pisifera Nigeria empat primer mampu menghasilkan marka RAPD polimorfis sedangkan satu primer menghasilkan marka yang monomorfis. Rataan jumlah marka RAPD yang dihasilkan sebanyak 3,2 marka RAPD per primer. Ukuran marka RAPD yang dihasilkan bervariasi antara 300 bp hingga 2500 bp. Data primer acak, urutan sekuen primer acak, jumlah marka RAPD dan ukuran marka RAPD yang dihasilkan oleh masing-masing primer disajikan pada Tabel 1. Dari total marka RAPD yang dihasilkan (16 marka), ditemukan 4 marka RAPD (25%) yang polimorfis, sedangkan sisanya (75%) merupakan marka RAPD monomorfis untuk sembilan aksesi pisifera Nigeria yang dianalisis. Tingkat polimorfisme marka RAPD antar tanaman dapat berbeda, yang antara lain disebabkan oleh: (1) perbedaan jumlah dan jenis primer, semakin banyak jumlah dan jenis primer yang digunakan maka polimorfisme yang dihasilkan juga akan semakin tinggi, dan (2) jenis populasi tanaman yang dianalisis (Kaidah et al. 1999) Populasi tanaman interspesifik (beda spasies) akan menghasilkan tingkat polimorfisme yang lebih tinggi dibandingkan populasi intraspesifik. Populasi tanaman bersegregasi hasil penyerbukan silang juga akan menghasilkan polimorfisme yang lebih tinggi dibandingkan populasi tanaman hasil selfing. Tabel 1. Jenis primer dan urutan sekuen primer acak, jumlah marka RAPD dan ukuran marka RAPD yang dihasilkan oleh masing-masing primer. No. Jenis Primer Sekuen (5 3 ) Jumlah Pita Ukuran Pita (bp) Total Polimorfis 1 OPC-14 TGCGTGCTTG 3 0 850 1200 2 OPC-09 CTCACCGTCC 3 1 1000 2500 3 OPH-06 ACGCATCGCA 3 1 600 1000 4 OPJ-01 CCCGGCATAA 2 1 900 1200 5 OPR-11 GTAGCCGTCT 5 1 300 1400 Total 16 4 300 2500
27 Populasi tanaman hasil perbanyakan seksual akan menghasilkan polimorfisme yang lebih tinggi dibandingkan populasi tanaman hasil perbanyakan vegetatif (klon hasil kultur jaringan) (Jayusman et al. 2002) Keragaman Genetik Berdasarkan Marka RAPD Individu-individu dalam satu populasi dapat dianalisis tingkat kesamaan profil marka RAPD-nya (berdasarkan hasil tingkat kesamaan genetik). Analisis tingkat kesamaan genetik yang didapat, individu-individu dalam populasi dapat dikelompokkan berdasarkan tingkat kesamaan genetik yang ada menggunakan analisis clustering. Selanjutnya hasil analisis clustering yang diperoleh dapat digunakan untuk menyusun pohon filogenetik untuk mengetahui posisi satu individu dengan individu lainnya dalam populasi. Hasil analisis tingkat kesamaan genetik (analisis clustering) dan penyusunan pohon filogenetik (dendogram) untuk 9 individu pisifera berdasarkan data marka RAPD disajikan pada Tabel 2 dan Gambar 7. Hasil analisis tingkat kesamaan genetik berdasarkan marka RAPD menunjukkan bahwa empat ramet klon pisifera Nigeria yang dianalisis mempunyai tingkat kesamaan genetik 1,00 (Tabel 2). Hal ini mengindikasikan bahwa ramet 2401, 2402, 2403 dan 2404 yang dievaluasi sebagai bahan tanaman klonal yang berasal dari satu ortet. Hasil analisis tingkat kesamaan genetik berdasarkan marka RAPD menunjukkan bahwa lima aksesi famili TxP pisifera Nigeria yang dianalisis mempunyai tingkat kesamaan genetik antara 0,83 0,97. Aksesi 320/3 dengan aksesi 320/8 mempunyai tingkat kesamaan genetik 0,97. Demikian pula aksesi 320/9 dengan aksesi 320/11 juga mempunyai tingkat kesamaan genetik 0,97. Tingkat kesamaan antara aksesi 320/3 dan 320/8 dengan aksesi 320/9 dan 320/11 sebesar 0,86. Sedangkan tingkat kesamaan aksesi 320/12 dengan empat aksesi lainnya sebesar 0,83 (Tabel 2). Berdasarkan tingkat kesamaan genetik lima aksesi tersebut mengindikasikan bahwa kelimanya mempunyai identitas genetik yang berbeda. Hasil tersebut memperkuat identitas lima aksesi yang dianalisis sebagai segregan hasil persilangan TxP pisifera.
28 Tabel 2. Nilai tingkat kemiripan antar empat individu ramet klon pisifera dan lima individu dari famili TxP berdasarkan data marka RAPD. 320/3 1,00 320/3 320/8 320/9 320/11 320/12 2401 2402 2403 2404 320/8 0,97 1,00 320/9 0,86 0,86 1,00 320/11 0,86 0,86 0,97 1,00 320/12 0,83 0,83 0,83 0,83 1,00 2401 0,86 0,86 0,91 0,91 0,83 1,00 2402 0,86 0,86 0,91 0,91 0,83 1,00 1,00 2403 0,86 0,86 0,91 0,91 0,83 1,00 1,00 1,00 2404 0,86 0,86 0,91 0,91 0,83 1,00 1,00 1,00 1,00 Keterangan : Tingkat kesamaan antar individu intra pisifera famili TxP ( ); antar individu interpopulasi pisifera Nigeria (TxP dan Klon) ( ); antar individu intra klon pisifera ( ). Jika dibandingkan tingkat kesamaan antara ramet klon pisifera dengan aksesi TxP pisifera yang dievaluasi, dapat diketahui bahwa ramet klon pisifera yang dievaluasi mempunyai tingkat kesamaan antara 0,83 0,91 dengan aksesi TxP pisifera (Tabel 2). Ramet klon pisifera mempunyai tingkat kesamaan yang 0.83 0.87 0.92 0.96 1.00 Koefisien Kemiripan 320/3 320/8 320/9 320/11 2401 2402 2403 2404 320/12 Gambar 7. Dendrogram hasil analisis UPGMA pada sembilan aksesi pisifera Nigeria menggunakan marka RAPD yang dihasilkan dari lima primer acak.
29 10.000 3.000 2.500 2.000 1.500 Pisifera TxP famili Pisifera Klon 320/3 320/ /8 320/9 320/11 320/122 2401 2402 2403 2404 1.000 750 500 250 Marker Gambar 8. Contoh visualisasi marka RAPD yang dihasilkan dengan menggunakan primerr acak, OPR-11. tertinggi (0,91) dengan aksesi 320/9 dan 320/11 dan terendah (0,83) dengan aksesi 320/12. Aksesi 320/3 dan 320/8 mempunyai tingkat kesamaan 0,86 dengan ramet klon pisifera (Tabel 2). Dendogram hasil analisis clustering berdasarkan data marka RAPD disajikan pada Gambar 7. Pada Gambar 8 disajikan contoh hasil visualisasi marka RAPD yang dihasilkan dengan menggunakan primer acak OPR-11. Seleksi Primer Spesifik SSR Hasil penelitian menunjukkann bahwa dari 5 pasang primer spesifik yang digunakan untuk menganalisis aksesi pisifera Nigeria seluruhnya mampu menghasilkan marka SSR yang polimorfis. Rataan jumlah allel SSR yang diamati sebanyak 2,6 per pasangan primer. Jumlah alel yang didapat untuk masing-masing pasangan primer yang diuji berkisarr antara 1-3 alel dan persentase alel polimorfik yang didapat sebesar 77%. Data primer spesifik, runutan sekuen primer, jumlah alel total dan alel polimorfiknya disajikan pada Tabel 3. Setiyo et al. (2001), menjelaskann bahwa polimorfisme merupakan variasi alel yang diwariskan sebagai akibat dari hilang atau merubah ukuran potongan DNA, antara lain karena:
30 Tabel 3. Nama primer, urutan sekuen primer, jumlah alel total dan alel polimorfik dalam analisis marka SSR. Primer Nama lokus Urutan Basa Jumlah Alel Total Polimorfis P-4 megcir3543 P-6 megcir3363 P-9 megcir1773 P-11 megcir3546 P-12 megcir3850 F GTTCCCTGACCATCTTTGAG R GTCGGCGATTGATTAGATTC F CTTGACAATACCCTGAGTAGTAG R GCTGTGCCTATCGGACTT F ATGACCTAAAAATAAAATCTCAT R ACAGATCATGCTTGCTCACA F GCCTATCCCCTGAACTATCT R TGCACATACCAGCAACAGAG F CCTCGGGTTATCCTTTTTACC R TGGCTGGCTTCGGTCTTAG 3 2 3 2 2 1 2 3 3 3 Total 13 11 (1) insersi DNA berukuran besar pada dua situs penempelan primer sehingga ukuran basa atau jarak amplifikasi menjadi terlalu besar untuk dapat dideteksi, (2) delesi bagian genom yang membawa situs penempelan, (3) substitusi nukleotida yang mengubah homologi antara primer dan DNA genom dan (4) insersi atau delesi fragmen kecil DNA yang dapat mengubah ukuran fragmen yang diamplifikasi. Keragaman Genetik Berdasarkan Marka SSR. Individu-individu dalam satu populasi dapat dianalisis tingkat kesamaan profil marka SSR-nya (berdasarkan hasil tingkat kesamaan genetik). Analisis tingkat kesamaan genetik yang didapat, individu-individu dalam populasi dapat dikelompokkan berdasarkan tingkat kesamaan genetik yang ada menggunakan analisis clustering. Selanjutnya hasil analisis clustering yang diperoleh dapat digunakan untuk menyusun pohon filogenetik untuk mengetahui posisi satu individu dengan individu lainnya dalam populasi. Hasil analisis tingkat kesamaan genetik (analisis clustering) dan penyusunan pohon filogenetik (dendogram) untuk 9 individu pisifera berdasarkan data marka SSR disajikan pada Tabel 4 dan Gambar 9.
31 Hasil analisis tingkat kesamaan genetik berdasarkan marka SSR menunjukkan bahwa empat ramet klon pisifera Nigeria yang dianalisis mempunyai tingkat kesamaan genetik 1,00 (Tabel 4). Hal ini mengindikasikan bahwa ramet 2401, 2402, 2403 dan 2404 yang dievaluasi sebagai bahan tanaman klonal yang berasal dari satu ortet. Hasil analisis tingkat kesamaan genetik berdasarkan marka SSR menunjukkan bahwa lima aksesi famili TxP pisifera Nigeria yang dianalisis mempunyai tingkat kesamaan genetik antara 0,68 0,84. Aksesi 320/3 dengan aksesi 320/9 mempunyai tingkat kesamaan genetik 0,80. Demikian pula aksesi 320/8 dengan aksesi 320/12 juga mempunyai tingkat kesamaan genetik 0,84. Aksesi 320/3 dan 320/9 memiliki tingkat kesamaan genetik sebesar 0,68 dengan aksesi 320/8 dan 320/12. Sedangkan aksesi 320/11 memiliki tingkat kesamaaan sebesar 0,68 dengan aksesi 320/3 dan 320/9. Demikian juga aksesi 320/11 memiliki tingkat kesamaan genetik dengan aksesi 320/8 dan 320/12 sebesar 0,70. (Tabel 4). Berdasarkan tingkat kesamaan genetik lima aksesi tersebut mengindikasikan bahwa kelimanya mempunyai identitas genetik yang berbeda. Hasil tersebut memperkuat identitas lima aksesi yang dianalisis sebagai segregan hasil persilangan TxP pisifera. Tabel 4. Nilai tingkat kemiripan antar empat individu ramet klon pisifera dan lima individu dari famili TxP berdasarkan data marka SSR. 320/3 320/8 320/9 320/11 320/12 2401 2402 2403 2404 320/3 1,00 320/8 0,68 1,00 320/9 0,80 0,68 1,00 320/11 0,68 0,70 0,68 1,00 320/12 0,68 0,84 0,68 0,70 1,00 2401 0,68 0,70 0,68 0,84 0,70 1,00 2402 0,68 0,70 0,68 0,84 0,70 1,00 1,00 2403 0,68 0,70 0,68 0,84 0,70 1,00 1,00 1,00 2404 0,68 0,70 0,68 0,84 0,70 1,00 1,00 1,00 1,00 Keterangan : Tingkat kesamaan antar individu intra pisifera famili TxP ( ); antar individu interpopulasi pisifera Nigeria (TxP dan Klon) ( ); antar individu intra klon pisifera ( ).
32 320/3 320/9 320/8 320/12 320/11 2401 2402 2403 2404 0.68 0.76 0.84 Koefisien Kemiripa an 0.92 1.00 Gambar 9. Dendrogram hasil analisis UPGMA pada sembilan aksesi pisifera Nigeria menggunakan marka SSR yang dihasilkan dari lima primer spesifik. Jika dibandingkan tingkat kesamaan antara ramet klon pisifera dengan aksesi TxP pisifera yang dievaluasi, dapat diketahui bahwa ramet klon pisifera yang dievaluasi mempunyai tingkat kesamaan antara 0,68 0,84 dengan aksesi TxP pisifera (Tabel 4). Ramet klon pisifera mempunyai tingkat kesamaan yang tertinggi (0,84) dengan aksesi 320/11 dan terendah (0,68) dengan Klon Pisifera dengan P-9 2404 2403 2402 2401 320/12 Famili TxP dengan P-9 320/11 320/9 320/8 320/3 2404 2403 2402 2401 Klon Pisifera dengan P-11 320/12 320/11 320/9 320/8 Famili TxP dengan P-11 320/3 Gambar 10. Visualisasi DNA hasil amplifikasi plasma nutfah kelapa sawit pisifera Nigeria menggunakan primer SSR, P-9 dan P-11.
33 aksesi 320/3 dan 320/9. Aksesi 320/8 dan 320/12 mempunyai tingkat kesamaan 0,70 dengan ramet klon pisifera (Tabel 4). Dendogram hasil analisis clustering berdasarkan data marka SSR disajikan pada Gambar 9. Pada Gambar 10 disajikan contoh hasil visualisasi marka SSR yang dihasilkan dengan menggunakan primer spesifik SSR, P-9 dan P-11. Perbandingan efektifitas penggunaan marka RAPD dan SSR untuk analisis keragaman genetik sembilan aksesi tanaman pisifera Nigeria disajikan pada Tabel 5. Berdasarkan informasi efektifitas marka RAPD dan SSR tersebut terlihat bahwa kedua marka dapat digunakan untuk analisis keragaman genetik karena : Tabel 5. Hasil perbandingan analisis marka RAPD dan marka SSR dari sembilan aksesi pisifera Nigeria. Perbandingan RAPD SSR Prinsip dasar Sifat marka Amplifikasi dengan primer acak (multi lokus) Dominan Amplifikasi dengan primer spesifik (multi alel) Kodominan Jumlah primer total 5 primer 5 pasang primer Jumlah primer yang menghasilkan marka polimorfis 4 primer 5 pasang primer Jumlah lokus atau alel total 16 13 Jumlah lokus atau alel polimorfis Persentase lokus atau alel polimorfis Rataan lokus atau alel per primer Koefisien kesamaan genetik seluruh pisifera Koefisien kesamaan genetik aksesi famili TxP pisifera Koefisien kesamaan genetik klon pisifera 4 11 25% 77% 3,2 2,6 0,83 0,68 0,83 0,68 1,00 1,00
34 (1) Secara umum kedua marka (RAPD dan SSR) mampu membedakan dengan jelas antara aksesi-aksesi pisifera Nigeria, baik aksesi famili TxP pisifera atau ramet klon pisifera. (2) Ramet klon pisifera memperlihatkan keseragaman yang tinggi sedangkan pisifera famili TxP terlihat beragam. Berdasarkan hasil analisis juga terlihat kalau marka SSR sebenarnya memiliki kelebihan bila dibandingkan dengan marka RAPD. Hal ini dapat dilihat dari : (1) Persentase marka polimorfis yang dihasilkan. Marka SSR menghasilkan nilai (77%) yang lebih tinggi dibandingkan dengan marka RAPD (25%). Perbedaan profil marka DNA (meliputi jumlah dan ukuran marka) sangat berperan dalam menentukan tingkat keragaman populasi kelapa sawit. Semakin banyak marka DNA polimorfis yang dihasilkan akan dapat lebih menggambarkan genom tanaman. (2) Marka RAPD mampu mengelompokkan seluruh pisifera Nigeria baik klon maupun famili TxP pada tingkat kesamaan (0,83) lebih tinggi dibandingkan marka SSR (0,68). Hal ini menunjukkan bahwa keragaman genetik yang mampu dihasilkan marka SSR lebih tinggi dibandingkan dengan marka RAPD. Ini juga membuktikan bahwa marka SSR merupakan marka yang memiliki ketelitian yang tinggi dan merupakan marka spesifik. (3) Marka SSR menunjukkan sifat kodominan dengan jumlah alel yang diperlihatkan pada tiap individu hanya 2 pita (sesuai genom kelapa sawit diploid 2n=32), berbeda dengan marka RAPD yang bersifat dominan dan memperlihatkan cukup banyak pita pada tiap individu. Sifat kodominan yang ditunjukkan pada marka SSR ini akan memudahkan penggenotipan tanaman untuk menentukan dan membedakan antara homozigot dominan, heterozigot dan homozigot resesif. Keberhasilan reaksi amplifikasi ditentukan oleh banyak faktor, antara lain dalam penggunaan primer. Setiyo et al. (2001) menjelaskan bahwa dalam analisis RAPD digunakan primer acak (arbitrary) tunggal yang akan mengamplifikasi beberapa segmen DNA target secara acak pada daerah-daerah yang dibatasi oleh sekuen yang berkomplemen dengan primer tersebut. Penggunaan primer acak yang kurang sesuai akan menghasilkan pola pita sama untuk satu populasi yang diamati atau bahkan tidak menghasilkan pola pita sama sekali. Ini berarti bahwa dalam melakukan analisis genetik dengan teknik RAPD diperlukan pemilihan primer acak dari sejumlah primer yang tersedia.
35 Kesimpulan Berdasarkan analisis yang dilakukan marka RAPD dan SSR mampu menunjukkan identitas empat ramet pisifera klon sebagai satu genotipe, hal ini menunjukkan bahwa keempat ramet tersebut benar-benar berasal dari sumber klonal. Marka RAPD dan SSR juga mampu mengidentifikasi secara tepat aksesi pisifera TxP yang secara genetik berbeda, menunjukkan bahwa pisifera TxP merupakan segregan atau rekombinan. Hasil analisis UPGMA menggunakan marka RAPD menempatkan pisifera klon pada kemiripan 0,83 0,91 terhadap aksesi pisifera TxP famili, sementara marka SSR menempatkannya pada 0,63 0,84.