PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMA, DMF DAN GLYCEROL PADA PROSES PEMBEKUAN SEMEN AYAM KAMPUNG

PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMA, DMF DAN GLYCEROL PADA PROSES PEMBEKUAN SEMEN AYAM KAMPUNG (Effect of DMA, DMF, and Glycerol Cryoprotectant on Frizing of Native Chicken Semen) S. SOPIYANA 1, S. ISKANDAR 1, T. SUSANTI 1 dan D. YOGASWARA 2 1 Balai Penelitian Ternak, PO Box 221, Bogor 16002 2 Fakultas MIPA, Universitas Pakuan, Bogor ABSTRACT One of the conservation efforts in conserving the germ plasma is done by semen conservation. Frozen semen generally used to lengthen semen live capacity. The problem encount in this process is cold shock and damage caused by ice crystal formation. Therefore, before frizing process, semen must be given cryoprotectant to prevent ice crystal formation and stabilize spermatozoa plasma membrane in frizzing The research aims at finding out the effect of DMA, DMF, and Glycerol cryoprotectant to semen quality of native chickens. Thirty native chicken were reared intensively in battered cages in Chicken Lab. at RIAP. These chickens were used as semen source with various treatments. The treatments used were three kinds of cryoprotectant (DMA, DMF, and Glycerol cryoprotectant) with two levels of concentration (5 and 7%) to get the highest percentage of frozen spermatozoa with maximum live thawing (about 50%) and motility above 40%. The results showed that the effect of three kinds of cryoprotectant on spermatozoa quality was not significantly different after being dilluted, equilibrated, and thawed. The average percentage of motility after thawing were 33.75% in DMA, 32.50% in DMF, and 33.13% in Glycerol, and live spermatozoa percentage in DMA, DMF, and Glycerol were 50.43, 48.37, and 48.12%, respectively with concentrations of 5 and 7%. Key Words: Spermatozoa, Cryoprotectant, Glycerol, DMA, And DMF ABSTRAK Salah satu upaya pelestarian plasma nutfah ayam Kampung adalah dengan konservasi semen. Proses pembekuan semen merupakan cara yang umum digunakan untuk memperpanjang daya hidup sperma. Masalah yang sering dihadapi dalam proses ini adalah cold shock dan kerusakan akibat terbentuknya kristal es. Oleh karena itu, sebelum proses pembekuan, semen hendaknya diberikan suatu zat pelindung yang disebut krioprotektan yang berfungsi menjaga terbentuknya kristal es dan menstabilkan membran plasma spermatozoa selama proses pembekuan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh krioprotektan DMA (Dimethyl Acetamide), DMF (Dimethyl Formamide), dan Glycerol terhadap kualitas semen ayam Kampung. Sebanyak 30 ekor ayam Kampung dewasa dipelihara intensif dalam kandang batere di Laboratorium Ayam Balai Penelitian Ternak yang dipakai sebagai sumber semen dengan perlakuan berupa pemakaian tiga jenis krioprotektan (DMA, DMF, dan Glycerol), dua macam konsentrasi (5 dan 7%) untuk mendapatkan persentase spermatozoa beku-thawing hidup (di atas 50%) dan tingkat motilitas di atas 40%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pengaruh tiga jenis krioprotektan (DMA, DMF, dan Glycerol) terhadap kualitas spermatozoa (motilitas dan spermatozoa hidup) tidak berbeda nyata setelah pengenceran, setelah ekuilibrasi, dan setelah thawing. Rata-rata persentase motilitas setelah beku-thawing pada masing-masing krioprotektan adalah DMA (33,75%), DMF (32,50%), dan Glycerol (33,13%), sedangkan persentase spermatozoa hidup pada berbagai jenis krioprotektan adalah DMA (50,43%), DMF (48,37%), dan Glycerol (48,12%), pada konsentrasi 5 dan 7%. Kata Kunci: Spermatozoa,, DMA, DMF, Glycerol PENDAHULUAN Ayam Kampung memiliki potensi tinggi dalam perkembangan petenakan nasional. Pemeliharaan dengan cara intensif dapat mempercepat dewasa kelamin pada ayam. Ayam Kampung yang dipelihara secara ekstensif mengalami dewasa kelamin atau 702

bertelur yang pertama relatif lambat, yaitu antara 6 7 bulan sedangkan bila dipelihara secara intensif mencapai dewasa kelamin pada umur 5 bulan, sehingga semennya sudah dapat ditampung. Dalam pelestarian ayam Kampung, galur murninya perlu dijaga diantaranya dengan melakukan kriopreservasi semen. Pembekuan semen merupakan cara yang umum digunakan untuk memperpanjang daya hidup sperma. Sebelum proses pembekuan, semen hendaknya diberi suatu zat pelindung (krioprotektan) yang berfungsi untuk melindungi dari keadaan cold shock dan kerusakan sel akibat terbentuknya kristal es. Di Indonesia upaya kriopreservasi semen ayam belum banyak dilakukan. yang umum digunakan pada pembekuan semen ayam di negara maju adalah DMA (dimethyl acetamide), DMF (dimethyl formamide), DMSO (dimethyl sulfoxide), etilenglikol, propilenglikol dan gliserol (HAMMERSTEDT dan GRAHAM, 1992; SURAI dan WISHART, 1996). Gliserol banyak digunakan sebagai krioprotektan karena kemampuannya memproteksi sangat baik, namun cara kerjanya bersifat kontraseptif secara in vivo saat berlangsung inseminasi (HAMMERSTEDT dan GRAHAM, 1992), maka GAZALI (2001) menyarankan krioprotektan yang cocok digunakan untuk pembekuan semen ayam adalah DMA dan DMF. Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui pengaruh kriprotektan DMA (Dimethyl Acetamide), dan DMF (Dimethyl Formamide), dan Glycerol dengan konsentrasi 5 dan 7% terhadap kualitas semen ayam Kampung. MATERI DAN METODE Sebanyak 30 ekor ayam Kampung jantan dewasa dipelihara secara intensif dalam kandang batere jantan, yang diletakkan berdekatan dengan ayam-ayam betina sebagai penggairah. Semen dikoleksi dua kali setiap minggu dengan teknik pengurutan selama delapan minggu berturut-turut. Evaluasi semen segar dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis meliputi pemeriksaan warna, volume, ph, kekentalan, spermatozoa hidup, motilitas, gerakan massa, konsentrasi, dan abnormalitas spermatozoa. Setelah dilakukan evaluasi pada semen secara individu dalam setiap tabung penampung, semen-semen yang kualitasnya baik kemudian dijadikan satu dalam tabung reaksi steril. Semen ayam diencerkan dengan larutan pengencer yang telah disiapkan, lalu dievaluasi motilitas dan spermatozoa hidup. Larutan pengencer semen dibuat dengan mencampurkan kuning telur 1,5 ml, glukosa 0,57 g, antibiotik penstrep 0,1 ml dan DMA atau DMF, atau Glycerol dengan konsentrasi 5 atau 7%. Kemudian pada setiap botol larutan pengencer ditambahkan air steril sebanyak 7,8 ml, sehingga volume pengencer mencapai 10 ml. Pengenceran kemudian dilakukan dengan mencampurkan larutan pengencer secukupnya untuk mendapatkan konsentrasi spermatozoa 400 x 10 6 /ml. Semen kemudian dikemas dalam ministraw (bervolume 0,25 ml/straw) dan ujung straw ditutup dengan serbuk polyvinyl chloride (PVC). Semen diencerkan dengan krioprotektan kembali dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis, setelah itu diekuilibrasi pada suhu 5 C selama 60 menit dan didinginkan dengan menempatkan straw-straw di atas rak khusus yang ditempatkan 10 cm di atas permukaan uap nitrogen cair selama 4 menit, kemudian langsung dimasukkan dalam nitrogen cair (suhu -196 C). Evaluasi secara mikroskopis dilakukan setelah ekuilibrasi dan setelah thawing meliputi motilitas dan spermatozoa hidup. Rancangan percobaan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap Pola Faktorial 2 x 3 dengan dua macam konsentrasi krioprotektan (5 dan 7%) dan tiga macam krioprotektan (DMA, DMF, dan Glycerol). Setiap perlakuan diulang 8 kali. Kesimpulan yang diambil berdasarkan uji Fisher (Fisher test). Apabila hasil uji F berbeda nyata, untuk membandingkan antar perlakuan dilakukan uji Duncan (LSR test). HASIL DAN PEMBAHASAN Semen segar ayam kampung Hasil evaluasi semen secara makroskopis dan mikroskopis disajikan pada Tabel 1. Warna semen yang diperoleh dari penelitian, rata-rata berwarna putih bersih 703

dengan konsistensi kental dan hanya sebagian kecil bening dengan konsistensi encer. Warna dan konsistensi semen ini menentukan konsentrasi sperma, bila semen kental dan berwarna putih pekat maka konsentrasi sperma tinggi, sebaliknya bila semen encer dan berwarna bening maka konsentrasinya rendah. Tabel 1. Hasil evaluasi makroskopis dan mikroskopis semen segar ayam Kampung Parameter + std Volume (ml) 0,28 ± 0,05 Warna Putih Konsistensi Kental Motilitas (%) 81,63 ± 3,54 Gerakan massa (+++/++++) Sperma hidup (%) 86,13 ± 3,68 Derajat keasaman (ph) 6,87 Konsentrasi (juta/ml) 1.355 ± 128,62 Abnormalitas (%) 15,75 ± 3,15 Normal (%) 84,25 ± 3.74 Volume semen per ejakulasi yang dihasilkan pada penelitian ini bervariasi antara 0,2 0,35 ml/ejakulasi dengan rataan 0,28 ml/ejakulasi. Hasil ini sesuai dengan perolehan UTAMI (1995) pada ayam buras yaitu berkisar antara 0,2 0,4 ml, namun lebih tinggi dibandingkan dengan perolehan ABDILLAH (1996) pada ayam Kampung yaitu 0,27 ml/ejakulasi. Meskipun demikian volume yang dihasilkan masih dalam kisaran normal untuk unggas yaitu sebesar 0,25 0,5 ml (TOELIHERE, 1985). derajat keasaman (ph) semen hasil penelitian adalah 6,87. Hasil ini menunjukkan bahwa semen berkualitas baik karena memiliki kisaran ph yang netral dan sesuai dengan hasil yang didapat oleh ABDILLAH (1996) pada semen ayam lokal yaitu ph 7 7,5. Ciri utama spermatozoa adalah motilitas atau daya geraknya yang dijadikan patokan paling sederhana dalam penilaian semen untuk inseminasi buatan. motilitas yang diperoleh adalah 81,63%, hasil ini lebih rendah dibandingkan dengan paparan KHAIRANI (1999) yaitu 92,98%. Kualitas pergerakan progresif massa spermatozoa hampir sama yang dilaporkan ISNAINI (2000) dan ABDILLAH (1996) dengan pergerakan massa (+++) sampai (++++), persentase motilitas 81% dan persentase spermatozoa hidup 86%. Hasil penelitian juga masih dalam batas normal menurut GARNER dan HAFEZ (2000), dimana motilitas pada unggas berkisar 60 80%. Lebih jauh dijelaskan bahwa gerakan massa berkisar antara baik (+++) sampai dengan sangat baik (++++) dimana pergerakan spermatozoa progresif dan membentuk gelombang massa yang tebal dan bergerak cepat, adalah termasuk kriteria baik sampai sangat baik (TOELIHERE, 1985). Hasil ini sama dengan perolehan MARDALESTARI (2005), pada ayam Arab. Gerakan massa spermatozoa mencerminkan gerakan individu spermatozoa. Semakin aktif dan semakin banyak spermatozoa yang bergerak, maka gerakan massa pun semakin bagus (semakin tebal dan pergerakannya semakin cepat). Warna dan konsistensi semen menentukan konsentrasi sperma, bila semen kental dan berwarna putih keruh maka konsentrasi sperma tinggi, sebaliknya bila sperma encer dan berwarna bening maka konsentrasinya rendah. konsentrasi sperma hasil penelitian 1.355 ± 128,62 juta/ml semen. Hasil ini ternyata lebih rendah dibandingkan dengan yang dilaporkan ISNAINI (2000) yaitu 2.100 juta/ml semen dan ABDILLAH (1996) yaitu 2.960 juta/ml semen. Juga lebih rendah dibandingkan dengan perolehan STURKIE (1976) yaitu 1.700 3.500 juta/ml semen. persentase sperma hidup sebesar 86,13%. Hasil ini lebih rendah dari perolehan ABDILLAH (1996) dan MARDALESTARI (2005) yaitu 91 dan 88%. Penyimpangan morfologi spermatozoa yang normal dipandang sebagai spermatozoa abnormal. Abnormalitas spermatozoa hasil penelitian rataan 15,75%. Hasil ini hampir sama dengan MARDALESTARI (2005) pada ayam Arab yaitu 14%, dan perolehan KHAIRANI (1999) yaitu 15-17,33% pada ayam Sentul. Salah satu faktor penyebab abnormalitas selain pada waktu proses pembentukan spermatozoa, juga waktu penanganan setelah penampungan dimana semen tercampur kotoran dan urine. Namun demikian, secara umum hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa secara keseluruhan semen yang diperoleh dalam penelitian ini, layak untuk digunakan baik untuk inseminasi buatan ataupun untuk dijadikan semen beku. 704

Kualitas spermatozoa setelah pengenceran Pengamatan kualitas spermatozoa setelah pengenceran meliputi persentase motilitas dan spermatozoa hidup. Motilita Persentase motilitas spermatozoa setelah pengenceran rata-rata mengalami penurunan baik itu dengan pemberian krioprotektan DMA, DMF, maupun Glycerol yang masing-masing konsentrasinya 5 dan 7% bila dibandingkan semen segar. Persentase motilitas spermatozoa ayam Kampung setelah pengenceran disajikan pada Tabel 2. Berdasarkan Tabel 2 dapat dilihat bahwa setelah pengenceran, persentase motilitas spermatozoa pada perlakuan jenis krioprotektan DMA (71,88%), DMF (75,63%), dan Glycerol (78,13%) secara statistik menunjukkan hasil tidak berbeda nyata. Diantara ketiga krioprotektan tersebut, perlakuan dengan Glycerol relatif lebih baik dibandingkan dengan DMA dan DMF. Persentase motilitas spermatozoa pada perlakuan konsentrasi 5% (71,58%) lebih rendah dibandingkan dengan perlakuan 7% (75,835%), namun secara statistik tidak berbeda nyata. Untuk pengaruh interaksi jenis krioprotektan dan konsentrasinya, ternyata pemberian krioprotektan Glycerol dengan konsentrasi 7% memperlihatkan persentase motilitas yang sama baiknya, mengingat secara statistik tidak menunjukkan perbedaan yang nyata. Untuk DMA 7%, hasil penelitian ini lebih tinggi dibandingkan dengan SETIOKO et al. (2002) pada entog yaitu 76,41%. Tingginya hasil penelitian ini diduga disebabkan bedanya bahan semen yang dipakai. Laporan UTAMI (1995) pada ayam Buras dengan pengencer NaCl kuning telur menghasilkan motilitas 80,70%. Spermatozoa hidup Spermatozoa hidup yang diamati dengan pewarnaan eosin nigrosin akan tetap berwarna jernih, sedangkan spermatozoa mati akan menyerap zat warna eosin nigrosin sehingga spermatozoa akan berwarna pink. Hal ini disebabkan pompa Na pada spermatozoa hidup bekerja dengan baik sedangkan pada spermatozoa mati pompa Na tidak bekerja. persentase spermatozoa hidup setelah pengenceran disajikan pada Tabel 3. Persentase hidup spermatozoa ayam Kampung setelah pengenceran pada perlakuan jenis krioprotektan DMF (84,81%) hasilnya sama baik dibandingkan dengan DMA (78,50%) dan Glycerol (80,31%) karena secara statistik tidak memberikan perbedaan yang nyata diantara Tabel 2. persentase motilitas spermatozoa ayam Kampung setelah pengenceran Setelah pengenceran 5% 71,25 ± 6,41 76,25 ±5,18 76,25 ± 5,18 71,58 ± 2,89 a 7% 72,50 ± 7,07 75,00 ± 5,35 80,00 ± 0,00 75,83 ± 3,83 a 71,88 ± 0,88 a 75,63 ± 0,88 a 78,13 ± 2,65 a Tabel 3. persentase spermatozoa hidup setelah pengenceran Setelah pengenceran 5% 77,75 ± 11,62 86,50 ± 4,20 82,88 ± 4,39 82,37 ± 8,11 a 7% 79,25 ± 9,58 83,13 ± 4,18 77,75 ± 7,40 80,04 ± 7,43 a 78,50 ± 10,32 a 84,81 ± 4,41 a 80,31 ± 6,44 a 705

ketiga perlakuan tersebut. Begitu juga pada perlakuan konsentrasi perlakuan 5% (82,37%)dan 7% (80,04%) secara statistik tidak berbeda nyata. Interaksi antara jenis krioprotektan dan konsentrasipun secara statistik tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap persentase hidup spermatozoa. Hasil penelitian ini tidak jauh dari perolehan MARDALESTARI (2005) pada ayam Arab, yaitu DMF dan DMA dengan konsentrasi 7% masing-masing 80,50 dan 83,38%. Kualitas spermatozoa setelah ekulibrasi Motilitas Hasil penelitian menunjukkan bahwa persentase motilitas spermatozoa yang diperoleh pada perlakuan jenis krioprotektan DMA (68,75%), DMF (70,63%), dan Glycerol (73,75%) tidak berbeda nyata. Begitu pula pengaruh konsentrasi 5% (70,00%) dengan 7% (72,08%) dan interaksi antara jenis krioprotektan dengan konsentrasi secara analisis statistik tidak memberikan hasil yang nyata. Setelah proses ekuilibrasi, dengan perlakuan Glycerol memberikan hasil relatif lebih tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa Glycerol memiliki peranan yang penting untuk menjaga kualitas motilitas spermatozoa alam proses ekuilibrasi. Menurut FERADIS (1999), secara tradisi, ekuilibrasi telah dianggap sebagai total waktu spermatozoa tetap kontak dengan Glycerol. Selama itu terjadi penetrasi Glycerol ke dalam spermatozoa untuk menjaga keseimbangan konsentrasi intraseluler dan ekstraseluler. Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa rataan persentase motilitas di atas 50%, menunjukkan kualitas spermatozoa dinilai memenuhi syarat motilitas yang baik sehingga dapat dilanjutkan ke tahap pembekuan semen. Kualitas spermatozoa setelah thawing Thawing adalah tingkat pencairan kembali setelah mengalami penyimpanan dalam nitrogen cair. Metode thawing yang umum digunakan adalah dengan menggunakan air hangat (35 selama 30 detik), air es (5 selama 5 menit), dan air panas (65 selama 5 detik). MARDALESTARI (2005) menyatakan bahwa metode thawing dengan air hangat nyata lebih baik dalam mempertahankan kualitas semen ayam Arab dibandingkan dengan air es. Motilitas Motilitas spermatozoa setelah proses thawing mengalami penurunan yang sangat besar dibandingkan setelah proses ekuilibrasi. Hal ini sangat wajar terjadi karena spermatozoa mengalami perjalanan yang sangat berat pada saat proses pembekuan, dimana pada proses ini terjadi perubahan suhu yang sangat tajam. Perubahan ini memungkinkan terjadinya cold shock pada spermatozoa tersebut dan pembentukan kristal-kristal es yang dapat membahayakan kelangsungan hidup dari spermatozoa. persentase motilitas spermatozoa setelah thawing disajikan pada Tabel 5. Berdasarkan Tabel 5 dapat dilihat bahwa pengaruh jenis krioprotektan, konsentrasi, dan interaksi antara keduanya tidak berbeda nyata. Pada perlakuan jenis krioprotektan DMA (33,75%) menghasilkan rataan motilitas yang lebih tinggi daripada DMF (32,50%) dan Glycerol (33,13%). Hasil perlakuan DMA mengindikasikan adanya interaksi dengan membran sel spermatozoa lebih baik dan dapat menjaga keseimbangan konsentrasi larutan di dalam dan di luar sel, serta memiliki kemampuan berdifusi yang lebih baik, yaitu Tabel 4. persentase motilitas spermatozoa ayam Kampung setelah ekuilibrasi Setelah 60 menit ekuilibrasi 5% 66,25 ± 9,16 70 ± 10,69 73,75 ± 5,18 70,00 ± 3,75 a 7% 71,25 ± 6,41 71,25 ± 3,54 73,75 ± 5,18 72,08 ± 1,44 a 68,75 ± 3,54 a 70,63 ± 0,88 a 73,75 ± 0,00 a Huruf sama pada kolom dan baris sama menunjukkan tidak berbeda nyata (P>0,05) 706

Tabel 5. persentase motilitas spermatozoa setelah thawing Setelah thawing 5% 33,75 ± 5,17 35,00 ± 5,34 31,25 ± 6,40 33,33 ± 5,64 a 7% 33,75 ± 5,17 30,00 ± 0,00 35,00 ± 5,34 32,91 ± 4,64 a 33,75 ± 5,00 a 32,50 ± 4,47 a 33,13 ± 6,02 a Tabel 6. persentase spermatozoa hidup setelah thawing Setelah thawing 5% 51,62 ± 4,47 46,37 ± 5,62 51,00 ± 6,23 49,66 ± 5,76 a 7% 49,25 ± 6,27 50,37 ± 4,81 45,25 ± 12,16 48,29 ± 8,31 a 50,43 ± 5,40 a 48,37 ± 5,46 a 48,12 ± 9,79 a bisa larut dengan air dan asam lemak tak jenuh sehingga kemungkinan untuk memproteksi membran sel spermatozoa lebih besar. Hal ini akan mencegah pembentukan kristal-kristal es intraseluler maupun ekstraseluler yang berukuran besar. Sementara itu, rendahnya motilitas pada perlakuan Glycerol dibandingkan dengan DMA dikarenakan Glycerol dapat mengakibatkan proses peroksidasi lipid yang lebih besar sehingga mengakibatkan kehilangan motilitas spermatozoa. Bila dilihat dari konsentrasi, dengan 5% (33,33%) menghasilkan motilitas yang lebih baik dari 7% (32,91%). Spermatozoa hidup Pengaruh perlakuan terhadap rataan persentase spermatozoa hidup setelah thawing disajikan pada Tabel 6. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada pengaruh yang nyata antara ketiga jenis krioprotektan, konsentrasi, dan interaksi keduanya. Untuk pengaruh perlakuan krioprotektan DMA (50,43%) memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan DMF (48,37%) dan Glycerol (48,12%). Hasil ini membuktikan bahwa kemampuan DMA dalam memproteksi membran plasma spermatozoa lebih baik. Terlindunginya membran plasma spermatozoa dan terjaganya keseimbangan elektrolit-elektrolit interna dan eksterna spermatozoa, maka proses metabolisme spermatozoa tersebut tidak terganggu sehingga dapat menjaga kelangsungan hidup spermatozoa. Hasil ini lebih tinggi bila dibandingkan dengan MARDALESTARI (2005) pada ayam Arab, untuk DMA dan DMF menghasilkan spermatozoa hidup yang masing-masing 46,75% dan 41,72%, dan SETIOKO et al. (2002) pada entog untuk DMA dan DMF menghasilkan spermatozoa hidup yang masing-masing 48,04 dan 39,88%. KESIMPULAN DAN SARAN Pengaruh tiga jenis krioprotektan (DMA, DMF, dan Glycerol) terhadap kualitas spermatozoa (motilitas dan spermatozoa hidup) tidak berbeda nyata setelah tahap pengenceran, ekuilibrasi, dan thawing. Peningkatan kualitas semen beku-thawing masih perlu dikaji dengan mencari jenis krioprotektan dan konsentrasi yang tepat. DAFTAR PUSTAKA ABDILLAH. 1996. Pengaruh Beberapa Pengencer Semen, Lama Penyimpanan Semen dan Waktu Inseminasi terhadap Fertilitas Spermatozoa Ayam Buras. Thesis. Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. 707

FERADIS. 1999. Penggunaan Antioksidan dalam Pengencer Semen Beku dan Metode Sinkronisasi Estrus pada Program Inseminasi Buatan Domba ST. Croix. Thesis. Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. GARNER, D.L. and E.S.E. HAFEZ. 2000. Spermatozoa and Seminal Plasma. In: Reproduction in Farm Animal. 7 th ed. Lea and Febringer, Philadelphia. GAZALI, M. 2001. Kriopreservasi Semen Entog dalam Upaya Produksi Itik Serati Menggunakan Teknologi Inseminasi Buatan. Thesis. Program Pascasarjana IPB, Bogor. HAMMERSTEDT, R. And J.K. GRAHAM. 1992. Cryopreservation of Poultry Semen: The Enigma of Glycerol. Cryobiol. 29: 26 38. ISKANDAR, S., S. SOPIYANA, R. HERNAWATI, E. MARDIAH dan E. WAHYU. 2005. Kualitas Sperma Pasca Beku-Thawing Ayam Pelung, Sentul, dan Kedu pada Larutan Dimethyl Acetamide (DMA) dan Dimethyl Formamide (DMF). Pros. Lokakarya Unggas Lokal. Universitas Diponegoro, Semarang (in press). ISNAINI, N. 2000. Kualitas Semen Ayam Arab dalam Pengencer NaCl fisiologis dan Ringers pada Suhu Kamar. J. Habitat (11): 233 237. KHAIRANI, L. 1999. Pengaruh Jenis (Dimethyl Acetamide, Dimethyl Formamide, atau Dimethyl sulfoxide) terhadap Kualitas Semen Ayam Sentul Pasca Thawing. Skripsi. Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran, Bandung. MARDALESTARI, R. 2005. Pengaruh Jenis dan Konservasi serta Metode terhadap Kualitas Semen Beku Ayam Arab (Fayoumi). Skripsi. Program Studi Biologi- FMIPA Universitas Pakuan, Bogor. SETIOKO, A.R., P. SITUMORANG, E. TRIWULANINGSIH, T. SUGIARTI dan D.A. KUSUMANINGRUM. 2002. Pengaruh dan Waktu Ekuilibrasi terhadap Kualitas dan Fertilitas Spermatozoa Itik dan Entog. Balai Penelitian Ternak, Bogor. STURKIE, P.D. 1976. Avian Physiology. 2 nd Ed. Ithaca. New York. Cornell University Press. SURAI, P.F. and G.J. WISHART. 1996. Poultry artificial insemination technology in the countries of the former USSR. World Poult. Sci. J. 52: 27 43. TOELIHERE. 1985. Inseminasi Buatan pada Ternak. Penerbit Angkasa, Bandung. UTAMI, I.A.P. 1995. Pengaruh Berbagai Macam Pengencer Semen dan Dosis Inseminasi Buatan terhadap Fertilitas dan Daya Tetas pada Ayam Buras. Thesis. Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. 708