BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Sampel rayap diambil dari Cagar Alam Yanlappa-Jasinga dan Kampus IPB- Dramaga, Bogor. Rayap diidentifikasi dan diuji perilaku agonistiknya di Laboratorium Biosistematika Serangga. Ekstraksi dan amplifikasi gen COI rayap dan gen 16S rrna bakteri simbion di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2013 sampai Juni 2014. Metode Penelitian Pengambilan dan Identifikasi Sampel Rayap Tanah M. gilvus Sampel rayap diambil dengan menggunakan teknik transek strip sensus dengan ukuran 1 x 10 meter. Metode ini dilakukan dengan cara peneliti berjalan sepanjang garis transek dan pengamatan dilakukan pada kedua sisi transek. Bila menjumpai sarang rayap peneliti berhenti di suatu titik (di sarang rayap) dan mencatat secara langsung posisi sampel dengan menggunakan GPS (Lampiran 1). Rayap yang sudah dikoleksi dari lapangan dibedakan untuk perlakuan lanjutan yaitu rayap kasta prajurit mayor dan minor disimpan di dalam alkohol 70% untuk diidentifikasi hingga tingkat spesies menggunakan buku identifikasi Ahmad (1959) dan Tho (1992) dengan mengukur panjang kepala dan mandibel, lebar kepala, meso- dan metanotum, dan ruas antena. Sebagian rayap disimpan di alkohol absolut untuk ekstraksi DNA rayap dan sebagian disimpan dalam botol dalam keadaan segar atau hidup untuk pengujian perilaku agonistik dan isolasi bakteri simbion dari saluran pencernaannya. Analisis Kekerabatan Rayap Tanah M. gilvus dengan Pendekatan Perilaku Uji Agonistik Rayap yang telah diidentifikasi kemudian digunakan untuk pengujian agonistik. Perilaku agonistik adalah kemampuan anggota koloni dalam mengenali dan membedakan antara anggota koloninya atau bukan anggota koloninya (Shelton dan Grace 1996). Rayap kasta pekerja dari setiap koloni digunakan untuk pengujian agonistik. Satu individu rayap pekerja dari dua koloni yang berbeda ditempatkan di wadah plastik sebagai arena pengujian dan diamati perilaku agonistiknya (Gambar 2). Setiap koloni rayap yang ditemukan, diujikan dengan keseluruhan koloni rayap yang ditemukan (Tabel 1). Hasil perilaku agonistik pada tiap koloni rayap dicatat dan dianalisis. Rayap pekerja yang diadu di dalam arena diamati dengan melihat perilakunya yaitu (1) tidak terlihat adanya reaksi, (2) antenasi dan grooming satu sama lain, (3) berkerumun atau thigmotaxis, (4) mengetuk-ketukkan kepala atau tubuh ke substrat, (5) lari berputar-putar, (6) menghindari satu sama lain, atau (7) berusaha menggigit. Perilaku nomor 1-4 menunjukkan bahwa rayap bersifat pasif, perilaku 5-6 merupakan respon menghindari atau menolak, sedangkan perilaku nomor 7 merupakan respon menyerang secara langsung (Delphia et al. 2003).
10 Rayap yang mempunyai perilaku menolak dilaporkan ketika kedua rayap saling menjauh, berusaha melarikan diri atau mundur dari yang lain. Rayap dengan perilaku menyerang secara langsung dilaporkan ketika rayap menyerang dan menggigit atau berusaha menggigit satu sama lain. 5 cm a b Gambar 2 Skema uji agonistik rayap kasta pekerja M. gilvus Keterangan: (a) pekerja dari koloni a, (b) pekerja dari koloni b Analisis Kekerabatan Rayap Tanah M. gilvus dengan Teknik Molekuler Ekstraksi, Amplifikasi, dan Sekuensing DNA gen COI pada Rayap Ekstraksi DNA rayap. DNA total rayap diekstraksi menggunakan metode Sambrook et al. (1989) yang telah dimodifikasi. Torak rayap kasta pekerja dipotong menggunakan scalpel dan dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml. Bagian torak dihancurkan sampai halus menggunakan micropestle di dalam tabung 1.5 ml kurang lebih selama 1 menit dengan terlebih dahulu ditambah bufer CTAB 2% (ph 8) sebanyak 200 μl yang mengandung mercapto-ethanol 0.2%. Suspensi diinkubasi pada suhu 65 ⁰C selama 15 menit. Larutan Chlorofoam: Isoamil alcohol (CI) (24:1) (v/v) sebanyak 200 μl ditambahkan ke dalam suspensi dan dibolak-balik selama 30 menit. Suspensi yang sudah dibolak-balik kemudian disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 10 000 rpm sehingga dihasilkan supernatan. Supernatan yang telah diperoleh dipindah ke tabung 1.5 ml yang baru sebanyak 150 μl. Larutan RNAse ditambahkan sebanyak 2 μl dan diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 20 menit. Larutan Isopropanol sebanyak 200 μl ditambahkan ke dalam supernatan untuk proses presipitasi (pengendapan DNA) dan diinkubasi di lemari pendingin pada suhu -20 ⁰C selama 3 jam atau semalam (overnight). Tabung yang berisi cairan supernatan DNA total rayap hasil inkubasi disentrifugasi pada suhu 4 ⁰C dengan kecepatan 12 000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang dan tersisa pelet yang mengandung DNA total. Pelet dicuci dengan etanol 70% sebanyak 700 μl dan disentrifugasi kembali pada suhu 4 ⁰C dengan kecepatan 12 000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang terbentuk kembali dibuang dan tersisa pelet DNA yang sudah bersih. Pelet DNA total rayap disuspensikan kembali dengan larutan Tris-EDTA (TE) ph 8(0.5 mm) (Lampiran 4) sebanyak 30 μl. Amplifikasi gen COI pada rayap. Amplifikasi gen COI pada rayap hasil ekstraksi dilakukan untuk dua individu M. gilvus dari tiap lokasi pengambilan sampel. Proses amplifikasi menggunakan mesin PCR (ESCO). Amplifikasi
fragmen gen COI M. gilvus menggunakan primer forward dan reverse dengan panjang amplikon sebesar 762 pb (pasang basa). Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen COI dari rayap M. gilvus merupakan hasil design manual dan perangkat lunak Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/). Primer forward dan reverse dibuat karena primer spesifik untuk gen COI pada rayap M. gilvus belum ada. Sekuen DNA mitokondria dari rayap M. barneyi (No. Akses Genbank: JX050221) digunakan sebagai dasar pembuatan design primer pada penelitian ini. Panjang amplikon dari primer forward dan reverse dari gen COI rayap M. barneyi berukuran sekitar 762 basa (Gambar 3). Masing-masing sekuen primer forward dan reverse mempunyai panjang 23 basa (Tabel 1). 11 1468 3017 trna-tyr COI trna-leu F-Mt D3 1733-1796 R-Mt D3 2489-2512 762 pb Gambar 3 Posisi primer forward dan reverse untuk amplifikasi gen COI berdasarkan DNAmt M. barneyi (No. aksesi JX050221) Tabel 1 Primer untuk amplifikasi gen COI dan posisi primer berdasarkan DNAmt M. barneyi (No. aksesi JX050221) Nama Primer Sekuen primer 5-3 Posisi primer F-Mt D3 GATTACTACCACCATCACTAACC 1773-1796 762 R-Mt D3 ACTACTCCTGTAAGTCCTCCTAT 2489-2512 Keterangan: F: Primer Forward, R: Primer Reverse, Mt: Mitokondria, D: Design Panjang amplikon (bp) Total volume reaksi PCR yang digunakan adalah 25 μl yang terdiri atas 9.5 μl air destilata steril, 1 μl primer forward 20 pm, 1 μl primer reverse 20 pm, 1 μl DNA cetakan, dan 12.5 μl PCR Master Mix 2X (Dream taqgreen Fermentas). Kondisi PCR menggunakan modifikasi Singla et al. (2013) yaitu pre-denaturation pada suhu 94 o C selama 5 menit, siklus yang digunakan sebanyak 35 (denaturation pada suhu 94 o C selama 1 menit, annealing pada suhu 50 o C selama 30 detik, extension pada suhu 72 o C selama 1 menit), dan final elongation pada suhu 72 o C selama 7 menit.
12 Hasil PCR kemudian dielektroforesis menggunakan agarose 1% pada tegangan 75 volt selama 30 menit dan divisualisasi menggunakan UV transilluminator. Pita-pita yang tervisualisasi kemudian dianalisis ukuran masingmasing fragmen DNA yang dibandingkan dengan marker 1 kb (Fermentas). Sekuensing DNA gen COI pada rayap. Identifikasi spesies lebih lanjut dilakukan analisis homologi basa nukleotida. Produk PCR disekuensing (proses ini dilakukan oleh perusahaan sekuensing) selanjutnya diolah menggunakan perangkat lunak BioEdit 7.2. (http://bioedit.software.informer. com/7.2/) untuk dibandingkan dengan sekuen database dari GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Analisis Homologi Sekuen DNA Gen COI pada Rayap Tanah M. gilvus Analisis homologi dilakukan pada sekuen gen COI M. gilvus dengan data GenBank. Program Basic Local Alignment Seacrh Tool-Nucleotide (BLAST-N) (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) digunakan untuk analisis homologi. Sekuen nukleotida gen COI M. gilvus di-alignment dengan data sekuen nukleotida gen COI rayap anggota Termitidae yang diperoleh dari GenBank (Tabel 2). Data sekuen nukleotida untuk gen COI M. gilvus yang diperoleh dari GenBank dianalisis homologi sekuen nukleotida gen COI menggunakan program Clustal W (Thompson et al. 1994) dan program BioEdit Versi 7.2. Analisis Filogeni dan Jarak Genetik Rayap Tanah M. gilvus Konstruksi pohon filogeni dilakukan antar gen COI M. gilvus (in-group) dan spesies rayap M. annandalei (out-group) (Tabel 2). Proses analisis filogeni tersebut menggunakan metode Neighbor-Joining (NJ) dan Maximum-Parsimony (MP) dengan bootstrap 1000x pada program MEGA 6 (Tamura et al. 2011). Analisis jarak genetik dilakukan antara gen COI M. gilvus dan M. annandalei (Tabel 2). Proses analisis jarak gen COI menggunakan program BioEdit Versi 7.2. Tabel 2 Database gen COI in-group dan out-group yang diperoleh dari GenBank untuk analisis filogeni dan jarak genetik Group Organisme Famili Kode No. aksesi Ingroup Outgroup M. gilvus Termitidae Mg 4 DMG - M. gilvus Termitidae Mg 6 DMG - M. gilvus Termitidae Mg 4 JSG - M. gilvus Termitidae Mg 5 JSG - M. gilvus Termitidae Mg 13 LAO AB909013 M. gilvus Termitidae Mg 14 LAO AB909014 M. gilvus Termitidae Mg 15 LAO AB909015 M. gilvus Termitidae Mg 16 LAO AB909016 M. gilvus Termitidae Mg 17 LAO AB909017 M. annandalei Termitidae Man 09 LAO AB909009 M. annandalei Termitidae Man 10 LAO AB909010 Keterangan: Mg: Macrotermes gilvus, Man: M. annandalei, DMG: Kampus IPB Dramaga, JSG: Cagar Alam Yanlappa-Jasinga, LAO: Laos (negara asal spesimen rayap)
13 Inventarisasi Bakteri Simbion Rayap Tanah M. gilvus Isolasi Bakteri Simbion pada Saluran Pencernaan Rayap Isolasi bakteri simbion pada saluran pencernaan dilakukan pada rayap kasta pekerja. Sebanyak tiga rayap kasta pekerja diambil dari masing-masing lokasi pengambilan sampel kemudian dicuci dengan air steril dan disterilisasi permukaan tubuhnya dengan alkohol 70% sebanyak 3 kali. Bagian tubuh yang telah disterilisasi permukaan kemudian dikelupas kutikula abdomen luarnya untuk diambil saluran pencernaan tengah (mesenteron) dan belakang (proktodeum). Saluran pencernaan tengah dan belakang yang sudah diperoleh lalu digerus di dalam tabung 1.5 ml menggunakan hand pestle dan ditambahkan air steril 1 ml. Tabung yang berisi suspensi bakteri diambil sebanyak 1 ml untuk ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi air steril 9 ml dan dilakukan pengenceran berseri yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, dan 10-5. Tabung reaksi yang berisi suspensi bakteri diambil sebanyak 0.1 ml untuk dilakukan pencawanan (platting) ke dalam media NA (Nutrient Agar) (Lampiran 2). Suspensi bakteri hasil pencawanan diinkubasikan pada suhu ruang (25 o C) selama 24 sampai 48 jam sebelum dikarakterisasi morfologi dan fisiologinya. Identifikasi Morfologi, Fisiologi, dan Molekuler Bakteri Simbion Identifikasi morfologi dan fisiologi. Isolat bakteri yang telah diisolasi diamati secara morfologi yaitu berdasarkan ciri-ciri warna, bentuk, dan pinggiran koloni. Isolat bakteri yang telah diisolasi diamati secara fisiologi yaitu berdasarkan sifat fisiologi menggunakan uji gram, dan uji aerobik (Schaad et al. 2001). Uji Gram dilakukan dengan mengambil satu inokulum dari isolat bakteri kemudian ditambahkan larutan KOH 3%. Suspensi bakteri yang terbentuk menunjukkan Gram positif (+) jika suspensi tidak berlendir (menggumpal) dan jika terbentuk terlihat adanya lendir menunjukkan isolat bakteri termasuk Gram negatif (-). Uji aerobik dilakukan dengan menumbuhkan bakteri ke media aerobik (Schaad et al. 2001). Isolat bakteri yang tumbuh jika berwarna hijau maka termasuk bersifat an-aerobik, jika tidak terlihat adanya perubahan warna pada media maka isolat bakteri bersifat aerobik. Identifikasi molekuler a. Ekstraksi DNA Bakteri Simbion Ekstraksi DNA total bakteri menggunakan metode Sambrook et al. (1989) yang telah dimodifikasi. Pelet bakteri yang sudah diperoleh dari hasil pembiakan di media NB (Nutrient Broth) (Lampiran 3), kemudian digunakan untuk ektraksi DNA bakteri. Pelet disuspensikan dengan 250 ul buffer TE (mengandung 5 mg/ml lisozym) kemudian di vortex sampai homogen. Suspensi bakteri diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit. Larutan SDS 10% sebanyak 50 ul ditambahkan dan dibolak-balik agar tercampur. Suspensi diinkubasi kembali pada suhu 37 o C selama 1 jam. Larutan NaCl 5M sebanyak 65 ul dan 80 ul CTAB-NaCl ditambahkan ke dalam suspensi dan diinkubasi kembali pada suhu 65 o C selama 20 menit. Larutan Clhorofoam:isoamil alkohol (24:1) (v/v) sebagai pelarut organik ditambahkan sebanyak 450 ul ke dalam suspensi dan dikocok dengan gentle menggunakan tangan selama 30 menit. Suspensi disentrifugasi pada kecepatan 11 000 rpm selama 15 menit pada suhu 25 0 C. Supernatan yang terbentuk ditransfer ke tabung
14 eppendorf baru sebanyak + 400 ul. Supernatan yang ditransfer ke tabung baru ditambahkan dengan isopropanol sebanyak 400 ul kemudian diinkubasi selama 30 menit atau semalam (overnight) pada suhu -20 0 C. Supernatan yang mengandung DNA total bakteri hasil presipitasi disentrifugasi pada suhu 4 ⁰C dengan kecepatan 12 000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang dan tersisa pelet yang mengandung DNA total. Pelet dicuci dengan etanol 70% dan disentrifugasi pada suhu 4 ⁰C dengan kecepatan 12 000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang terbentuk kembali dibuang dan tersisa pelet DNA yang sudah bersih. Pelet disuspensikan kembali dengan larutan TE ph 8 (0.5 mm) sebanyak 30 μl. b. Amplifikasi gen 16S rrna Bakteri Simbion Amplifikasi gen 16S rrna bakteri simbion hasil ekstraksi dilakukan pada bakteri simbion hasil identifikasi morfologi dan fisiologi dari masing-masing isolat. Proses amplifikasi menggunakan mesin PCR (ESCO). Primer yang digunakan adalah primer unversal 27F (5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) (Lane 1991) dan 1492R (5 -TTACCTTGTTACGACTT-3 ) (Turner et al. 1999). Amplifikasi fragmen gen 16S rrna menggunakan primer universal forward dan reverse yang akan menghasilkan amplikon dengan panjang 1500 pb (pasang basa). Total volume reaksi PCR yang digunakan adalah 25 μl yang terdiri atas 9.5 μl air destilata steril, 1 μl primer forward 20 pm, 1 μl primer reverse 20 pm, 1 μl DNA cetakan, dan 12.5 μl PCR Master Mix 2X (Dream taqgreen Fermentas). Kondisi PCR, pre-denaturation pada suhu 95 o C selama 5 menit, siklus yang digunakan sebanyak 35 (denaturation pada suhu 95 o C selama 1 menit, annealing pada suhu 55 o C selama 1 menit, extension pada suhu 72 o C selama 2 menit), dan final elongation pada suhu 72 o C selama 10 menit. Hasil PCR kemudian dielektroforesis menggunakan agarose 1% pada tegangan 75 volt selama 30 menit dan divisualisasi menggunakan UV transilluminator. Pita-pita DNA yang tervisualisasi kemudian dianalisis ukuran masing-masing fragmen DNA yang dibandingkan dengan marker 1 kb (Fermentas). c. Sekuensing DNA Gen 16S rrna Bakteri Simbion Identifikasi spesies lebih lanjut dilakukan dengan analisis homologi basa nukleotida. Hasil amplifikasi gen 16S rrna bakteri simbion disekuensing (proses ini dilakukan oleh perusahaan sekuensing) selanjutnya diolah menggunakan perangkat lunak BioEdit 7.2 (http://bioedit.software.informer.com/7.2/) untuk dibandingkan dengan sekuen database dari GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). d. Homologi DNA Gen 16S rrna Bakteri Simbion Analisis homologi dilakukan pada sekuen gen 16S rrna bakteri simbion dengan data GenBank. Program Basic Local Alignment Seacrh Tool-Nucleotide (BLAST-N) (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) digunakan untuk analisis homologi.