III. METODE PENELITIAN A. BAHAN 1. Bahan Baku Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah santan segar. Sedangkan sumber papain diambil dari perasan daun pepaya yang mengandung getah pepaya dan sumber bromelin adalah daging buah nenas, ragi roti jenis fernipam, untuk starter ragi tape menggunakan ragi tape yang diperam dalam skim kelapa dan air kelapa sebagai nutrisi. 2. Bahan Kimia Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah alkohol, kalium hidroksida, phenolthalein, asam asetat glasial, kloroform, kalium iodida, natrium thiosulfat, amilum, asam sulfat, natrium hidroksida, asam klorida, natrium hidroksida, asam borat, kasein, tirosin, kalsium klorida, asam trikloroasetat, natrium karbonat, folin komersil. B. ALAT-ALAT Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan, parutan kelapa mekanis, pisau stainless steel, kain saring halus, tampah plastik, gelas ukur, aluminium foil, pipet tetes, blender, soxhlet aparatus, oven, desikator, pendingin tegak. C. METODE PENELITIAN Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap, meliputi persiapan bahan meliputi pembuatan enzim bromelin kasar, pembuatan enzim papain kasar, pembuatan starter ragi tape dan mempersiapkan ragi roti jenis fernipam. Selanjutnya melakukan ekstraksi minyak kelapa dan karakterisasi sifat fisiko kimia minyak kelapa yang dihasilkan. Diagram alir penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 1.
1. PERSIAPAN BAHAN Pada penelitian ini proses diawali dengan pemarutan daging kelapa yang sebelumnya dilakukan penimbangan terhadap berat dan volume kelapa utuh, serabut kelapa, tempurung, dan air kelapa. Daging kelapa yang telah diparut dianalisa meliputi kadar air dan kadar minyak (ekstraksi Soxhlet). Adapun prosedur analisisnya dapat dilihat pada Lampiran 2. Daging kelapa yang telah diparut diberi penambahan air 70 0 C (1:2, dimana 1 kg daging kelapa parut ditambahkan 2 liter air 70 0 C) maupun air kelapa (1:1, dimana 1 kg daging kelapa parut ditambahkan 1 liter air kelapa). Setelah itu campuran daging kelapa parut dengan pelarut diblender, diperas, dan disaring untuk mendapatkan santan kelapa. Enzim pemecah emulsi yang digunakan pada penelitian ini adalah ragi roti (Saccharomyces cerevisiae) jenis fernipam, enzim papain kasar, enzim bromelin kasar, dan starter ragi tape. Enzim papain kasar diperoleh dari daun papaya yang telah dirajang di tambah air dengan perbandingan 1 gram daun papaya ditambahkan 15 mililiter air, kemudian diblender dan diperas yang selanjutnya disaring untuk memisahkan air yang mengandung papain dari ampas daun papaya. Enzim bromelin kasar berasal dari buah nenas yang telah dikupas, diblender dan diperas sehingga dihasilkan jus nenas yang mengandung bromelin. Sedangkan starter ragi tape dibuat dengan menambahkan 50 ml ke dalam skim kelapa 450 ml, kemudian ditambahkan ragi tape sebanyak 2 gram, lallu diaduk hingga homogen. Setelah homogen larutan tersebut diperam/difermentasi selama 12 jam. Penambahan air kelapa bertujuan untuk memperkaya nilai gizi media untuk perbanyakan ragi tape (Rindengen et.al., 2005). Diagram alir pembuatan starter ragi tape dapat dilihat pada Gambar 1. 22
Skim Kelapa 450 ml Air Kelapa 50 ml Ragi tape padat (2 g) Diaduk sampai homogen Didiamkan (12 jam) Starter Ragi Tape Gambar 1. Pembuatan Starter Ragi Tape (Rindengan et.al, 2005) 2. EKSTRAKSI MINYAK KELAPA a. Ekstraksi Minyak kelapa dengan Pemecah Emulsi Ragi Roti (Saccharomyces serevisiae). Pada penelitian ini, perlakuan jenis pelarut yang ditambahkan untuk mengekstraksi santan/krim kelapa adalah air 70 0 C dan air kelapa. Perlakuan dengan menambahkan air 70 0 C dan kelapa yang telah diparut untuk ekstraksi santan kelapa dimana perbandingan jumlah air dengan kelapa parut adalah 2:1 (1 kg daging kelapa parut ditambahkan 2 liter air) (Herawati, 1993). Sedangkan air kelapa 1:1 (1 kg daging kelapa parut ditambahkan 1 liter air kelapa) yang ditambahkan untuk ekstraksi santan kelapa. Setelah air 70 0 C maupun air kelapa ditambahkan, campuran kelapa parut dan pelarut diblender, diperas, dan disaring. Santan hasil pemerasan dibiarkan selama satu malam di suhu ruang (25 0 C-27 0 C), maka santan akan terpisah menjadi dua bagian. Bagian atas disebut santan kepala (krim) dan bagian bawah disebut air santan (skim), kemudian skim/air santan dipisahkan dari santan kepala. Santan kepala yang telah dipisahkan dari air santan ditambah ragi roti jenis fernipam sebanyak 1,5 g per kg kelapa parut (Arif, 1991). Selanjutnya 23
santan kepala diperam pada suhu 25 0-27 0 C selama 10 jam. Botol Aqua ditutup agar santan tidak terkena debu atau dimasuki oleh hewan. Keesokan harinya dapat dilihat bahwa santan kepala tersebut telah terbagi menjadi tiga lapisan yaitu minyak dan galendo (protein), air dan pekatan protein/air bibit, serta padatan. Air bibit dan padatan yang berada di lapisan bawah dipisahkan dengan cara melubangi bagian bawah botol aqua, sehingga minyak dan galendo terpisah dengan air bibit dan padatan. Untuk memudahkan pemisahan, minyak dan galendo perlu dipanaskan. Pemanasan dilakukan sampai galendo menggumpal sehingga mudah disaring. Tiap kilogram kelapa hanya memerlukan pemanasan kurang lebih 10 15 menit. Minyak dipisahkan dari galendo dengan cara penyaringan dan pemerasan dengan menggunakan kain saring yang cukup halus. Minyak yang diperoleh masih banyak mengandung air. Air tersebut dihilangkan dengan pemanasan selama kurang lebih 5 menit. Adapun diagram alir ekstraksi minyak kelapa dengan pemecah emulsi ragi roti dan air sebagai pelarut dapat dilihat pada Lampiran 3, sedangkan air kelapa sebagai pelarut pada Lampiran 4. b. Ekstraksi Minyak Kelapa dengan Pemecah Emulsi Enzim Papain Hasil parutan daging buah kelapa yang sebelumnya telah dihilangkan testanya dan ditambahkan air hangat yang bersuhu 70 0 C dengan perbandingan 1:1 (1 kg daging kelapa parut dibutuhkan 1 liter air). Sedangkan Air kelapa yang ditambahkan untuk ekstraksi santan kelapa dengan perbandingan 1:1 (1 kg daging kelapa parut dibutuhkan 1 liter air kelapa). Campuran kelapa parut dan pelarut kemudian diblender, diperas dan disaring. Santan kemudian didiamkan (kriming) selama 3 jam pada suhu ruang (25 0 C-27 0 C). Setelah itu dimasukkan ke dalam wadah aqua botol dan dilakukan pemisahan krim dari skim dan endapan dengan melubangi bagian bawah wadah aqua botol, krim atau santan kepala yang dipisah ditambahkan enzim papain kasar 30% (v/v) dan dilakukan pemeraman selama 24 jam di suhu ruang (25 0 C-27 0 C) (Husna, 1998). 24
Setelah pemeraman selama 24 jam minyak dan galendo akan terpisah dengan air bibit dan padatan. Air bibit dan padatan yang berada di lapisan bawah dipisahkan dengan cara melubangi bagian bawah botol aqua, sehingga minyak dan galendo benar-benar terpisah dari air bibit dan padatannya. Minyak dan galendo dipanaskan selama 5-10 menit untuk memisahkan galendo dan minyak per kilogramnya. Galendo akan menggumpal dan minyak disaring dengan kain saring halus. Diagram alir ekstraksi minyak kelapa dengan pemecah emulsi enzim papain kasar dan pelarut air 70 0 C dapat dilihat pada Lampiran 3, sedangkan air kelapa sebagai pelarut pada Lampiran 4. c. Ekstraksi Minyak Kelapa dengan Pemecah Emulsi Enzim Bromelin Kasar Pada dasarnya ekstraksi minyak kelapa dengan pemecah emulsi enzim bromelin kasar sama dengan ekstraksi minyak kelapa dengan pemecah emulsi enzim papain, yang membedakan hanya jenis enzim dan jumlah enzim yang ditambahkan ke dalam krim santan. Enzim bromelin kasar yang ditambahkan ke dalam krim/santan kepala sebanyak 25% (v/v) (Husna, 1998). Diagram alir ekstraksi minyak kelapa dengan pemecah emulsi enzim bromelin dan air 70 0 C sebagai pelarut dapat dilihat pada Lampiran 3, sedangkan air kelapa sebagai pelarut pada Lampiran 4. d. Ekstraksi Minyak Kelapa dengan Pemecah Emulsi Starter Ragi Tape Sama halnya dengan ekstraksi minyak kelapa menggunakan ragi roti (Saccharomyces cerevisiae) bedanya pada ekstraksi ini digunakan starter ragi tape. Daging kelapa yang sudah diparut diberi air 70 0 C dengan perbandingan 1:2 (1 kg daging kelapa parut ditambahkan 2 liter air). Sedangkan air kelapa yang ditambahkan untuk ekstraksi santan kelapa dengan perbandingan 1:1 (1 kg daging kelapa parut ditambahkan 1 liter air kelapa). Campuran kelapa parut dan pelarut kemudian diblender, diperas, dan disaring. Santan hasil pemerasan dibiarkan selama 2 jam di dalam suhu ruang (25 0 C-27 0 C), maka santan akan terpisah menjadi krim dan skim. Krim (santan kepala) dan skim (air santan) dipisahkan dalam wadah botol aqua 25
dengan melubangi bagian bawah botol aqua. Santan kepala yang telah dipisahkan ditambah starter ragi tape sebanyak 20% (v/v). Selanjutnya santan kepala diperam pada suhu 25 0-27 0 C selama 8 10 jam. Keesokan harinya dapat dilihat bahwa santan kepala tersebut telah terbagi menjadi tiga lapisan yaitu minyak dan galendo (protein) pada lapisan atas, air dan pekatan protein/air bibit di lapisan tengah, serta pada lapisan bawah adalah padatan. Kemudian air bibit dan padatan dipisahkan dengan melubangi bagian bawah wadah aqua botol. Adapun diagram alir ekstraksi minyak kelapa dengan pemecah emulsi starter ragi tape dan air 70 0 C sebagai pelarut dapat dilihat pada Lampiran 3, sedangkan air kelapa sebagai pelarut pada Lampiran 4. e. Pengukuran Aktivitas Enzim Protease Pengukuran aktivitas enzim secara umum digolongkan menjadi tiga kategori (Perlmann dan Lorand, 1970 di dalam Colowick dan Kaplan, 1970), bergantung pada tujuan eksperimen, yaitu : 1. Penentuan jumlah enzim tertentu yang terdapat dalam campuran enzim kasar misalnya dalam ekstrak jaringan. 2. Penentuan aktivitas yang tersisa dalam enzim murni setelah enzim tersebut mengalami perlakuan fisik atau kimia. 3. Penentuan aktivitas relatif dalam substrat yang spesifik, untuk memberikan spesifitas yang diberikan oleh enzim. Pengukuran aktivitas enzim protease juga dilakukan terhadap ragi roti, enzim papain kasar dan bromelin kasar, dan starter ragi tape. Pengukuran dilakukan untuk melihat aktivitas enzim yang diberikan yang dinyatakan dalam IU/g. Pengujian aktivitas protease dilakukan dengan metode Bergmeyer. Prinsip penetapan aktivitas adalah sebagai berikut : Kasein H 2 O Protease peptida + asam amino 26
Laju pembentukan peptida dan asam amino dari reaksi diatas dapat dijadikan tolak ukur aktivitas katalitik dari enzim protease. Asam amino yang telah terbentuk harus diisolasi dan dipisahkan dari substrat yang tersisa. Cara umum yang dilakukan adalah dengan menambahkan asam trikloroasetat (TCA) atau asam perklorat. Asam amino yang telah diisolasi dapat langsung diukur absorbansinya pada 280 atau diwarnai terlebih dahulu dengan pereaksi Folin Ciocalteu agar dapat dilakukan pembacaan pada daerah sinar tampak. Prosedur pengujian aktivitas protease berdasarkan prosedur pengujian aktivitas protease oleh Bergmeyer dan Grassl (1983) dapat dilihat pada Lampiran 2. Berdasarkan perjanjian internasional, aktivitas protease dinyatakan dalam International Unit (IU). D. PENGAMATAN Pengamatan diawali dengan penimbangan berat dan volume kelapa segar yang meliputi sabut, tempurung dan air kelapa. Adapun diagram alir penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 1. Pengamatan selanjutnya yaitu komposisi bahan baku daging buah kelapa segar dan sifat fisiko-kimia minyak kelapa kasar. Analisa komposisi bahan baku meliputi kadar air dan kadar minyak. Analisa fisiko-kimia minyak kelapa kasar yang dihasilkan meliputi kadar air, rendemen minyak, bilangan peroksida, bilangan penyabunan, bilangan asam. Setelah dilakukan analisa fisiko-kimia pada minyak kelapa, pengukuran aktivitas enzim protease yang dilakukan pada ragi roti, enzim papain, enzim bromelin dan starter ragi tape. Adapun prosedur analisa fisiko kimia dan pengukuran aktivitas enzim protease pada penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 2. Massa yang diperoleh dari setiap tahapan proses ekstraksi minyak kelapa seperti krim/santan kepala, krim/air santan, air bibit dan minyak kelapa juga ditimbang. Proses ekstraksi minyak kelapa menggunakan pemecah emulsi seperti ragi roti, enzim papain kasar, enzim bromelin kasar, dan starter ragi tape dengan air 70 0 C sebagai pelarut dapat dilihat pada Lampiran 3. Sedangkan 27
proses ekstraksi minyak kelapa menggunakan pemecah emulsi dan air kelapa sebagai pelarut dapat dilihat pada Lampiran 4. E. RANCANGAN PENELITIAN Penelitian ini menggunakan Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) dengan dua faktor dua kali ulangan. Faktor yang diblok adalah jenis pelarut yaitu air 70 0 C dan air kelapa. Sedangkan jenis pemecah emulsi yang digunakan ada empat yaitu penambahan ragi roti (Saccharomyces cerevisiae), enzim papain kasar, enzim bromelin kasar dan starter ragi tape. Model statistika yang digunakan adalah sebagai berikut : Yijk i j ijk Keterangan : Y ijk μ α i β j = Nilai pengaruh penambahan pemecah emulsi ke-i, penambahan pelarut ke-j, dan ulangan ke-k. = Nilai rata-rata populasi = Pengaruh jenis pelarut untuk ekstraksi minyak kelapa ke-i = Pengaruh jenis pemecah emulsi ke-j ε ijk = Pengaruh galat percobaan penambahan pemecah emulsi ke-i, penambahan pelarut ke-j, dan ulangan ke-k. 28