IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

20 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Isolasi Bakteri Penitrifikasi Sumber isolat yang digunakan dalam penelitian ini berupa sampel tanah yang berada di sekitar kandang ternak dengan jenis ternak berupa sapi, kerbau, kambing dan ayam. Lokasi pengambilan sampel tanah ini berada di 14 daerah yang berada di sekitar Kabupaten Bogor (Tabel 1). Pengambilan sampel tanah dilakukan di sekitar kandang ternak dengan alasan bahwa tanah di sekitar kandang ternak tersebut mengandung nitrat yang berasal dari kotoran ternak. Kotoran ternak tersebut, baik berupa feses ataupun urinnya mengandung nitrogen. Variasi kandungan nitrogen tersebut bergantung pada pakan yang dikonsumsi, tingkat kelarutan protein kasar pakan, serta kemampuan ternak untuk memanfaatkan nitrogen asal pakan (Mathius, 2010). Menurut Holt et al. (1994), pada umumnya bakteri penitrifikasi yang memiliki habitat di tanah berasal dari genus Nitrosomonas dan Nitrobacter. Selain itu, digunakan pula media spesifik untuk masing-masing bakteri tersebut. Sehingga diduga bahwa isolat bakteri penitrifikasi ( Nitrosomonas dan Nitrobacter ) yang diperoleh dari sampel tanah di sekitar kandang ternak ini merupakan bakteri yang berasal dari kedua genus bakteri tersebut. Namun, masih diperlukan karakteristik dan identifikasi lebih lanjut untuk mengetahuinya. Kandungan nitrat yang tinggi pada sampel yang berasal dari tanah di sekitar kandang ternak diduga merupakan habitat yang sangat baik bagi populasi Nitrosomonas sp. dan Nitrobacter sp. Kedua jenis bakteri ini disebut pula sebagai bakteri penitrifikasi (Nitrifying Bacterial). Keberadaan populasi bakteri nitrifikasi di dalam tanah sering dipakai sebagai indikator penting dalam menilai kualitas atau kesehatan tanah karena jumlah jenisnya yang terbatas (Ropel dan Ophel- Keller, 1997 dalam Simanungkalit et al., 2007). Tanah-tanah tersebut selanjutnya diinokulasikan ke dalam media spesifik dalam bentuk cair untuk isolasi Nitrosomonas dan Nitrobacter. Metode isolasi yang digunakan adalah enrichment culture yang diungkapkan pertama kali oleh Winogradsky dan Beijerinck. Metode ini digunakan untuk isolasi dan studi mengenai tipe fisiologi mikrob yang eksis di alam. Penting digunakan dalam skala

21 mikro pada seleksi alami. Media kultur berisi komposisi kimia tertentu dinokulasikan dengan populasi mikrob, misalnya dari sejumlah tanah, dan kemudian dilakukan pengujian terhadap mikrob apa yang dominan tumbuh (Stanier et.al, 1976). Enrichment culture ini dilakukan sebanyak 4 kali, tujuannya adalah untuk meminimalisir kandungan bahan organik yang terkandung di dalam sampel tanah sehingga akan mengurangi bakteri heterotrof, mengisolasi mikrob spesifik, serta mengetahui masa produktif dari mikrob. Metode ini menggunakan medium diperkaya, yaitu medium yang ditambahkan zat tertentu yang merupakan nutrisi spesifik untuk jenis mikroba tertentu, sehingga dapat digunakan untuk bakteri yang bersifat kemoheterotrof, kemautotrof, fotosintetik, dan untuk mikrob lain yang bersifat spesifik (Sumarsih, 2008). Kultur isolat yang diperoleh dari 14 sampel tanah yaitu masing-masing sebanyak 14 kultur isolat Nitrosomonas dan Nitrobacter. Setiap isolat tersebut kemudian dipindahkan ke dalam kultur cair dengan konsentrasi yang berbeda-beda, yaitu 250 ppm (NH 4 ) 2 SO 4, 500 ppm (NH 4 ) 2 SO 4, dan 1000 ppm (NH 4 ) 2 SO 4. Hal ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi mana yang menunjukkan aktivitas Nitrosomonas dan Nitrobacter paling optimal dalam menurunkan konsentrasi amonium dan meningkatkan konsentrasi nitrat. Pada tahap seleksi kemampuan tiap isolat ini, hanya dilakukan penetapan terhadap konsentrasi amonium dan nitrat,sedangkan penetapan konsentrasi nitrit tidak dilakukan. Hal ini dikarenakan nitrit yang terbentuk sangat sedikit, hal ini karena nitrit bersifat reaktif, tidak stabil, dan merupakan senyawa peralihan dari oksidasi amonium menjadi nitrat (Tresnawati, 2006). Kemudian, dari masing-masing kultur isolat dengan variasi konsentrasi (NH 4 ) 2 SO 4 tersebut dipilih 5 isolat NitrosomonasI dan Nitrobacter terbaik. Kultur isolat dengan konsentrasi (NH 4 ) 2 SO 4 yang memberikan hasil optimal untuk aktivitas Nitrosomonas maupun Nitrobacter juga dipilih masing-masing sebanyak 5 isolat. Setelah itu, 5 pasang isolat tersebut digabungkan dan dikombinasikan satu sama lain, sehingga diperoleh 25 kombinasi pasangan isolat Nitrosomonas dan Nitrobacter untuk dilakukan pengujian terhadap

22 kemampuannya dalam menurunkan konsentrasi amonium dan meningkatkan konsentrasi nitrat. 4.2. Seleksi Nitrosomonas sp. yang Memiliki Kemampuan Tinggi dalam Mengoksidasi Amonium Nitrosomonas merupakan bakteri kemoautotrof yang membutuhkan sumber energi berupa amonium. Pengukuran konsentrasi amonium yang mampu dioksidasi oleh Nitrosomonas dilakukan pada isolat dalam medium yang memiliki konsentrasi (NH 4 ) 2 SO 4 yang berbeda, yaitu 250 ppm, 500 ppm, dan 1000 ppm. Pengukuran konsentrasi amonium ini dilakukan pada hari ke-0, ke-4, ke-8, ke-12, dan ke-16. Pengukuran konsentrasi amonium juga dilakukan terhadap blanko. Blanko ini merupakan faktor koreksi untuk tiap kali pengukuran dan dapat dijadikan indikasi terjadinya kontaminasi. Konsentrasi amonium yang terukur pada hari ke-0 dari tiap isolat lebih rendah dibandingkan blanko, baik isolat dalam medium dengan konsentrasi (NH 4 ) 2 SO 4 sebesar 250 ppm, 500 ppm, maupun 1000 ppm. Hal ini disebabkan tiap isolat telah diinkubasi selama 48-72 jam, sehingga selama waktu inkubasi tersebut konsentrasi amonium telah mengalami penurunan dan konsentrasinya mulai terukur, serta nilainya lebih rendah dibandingkan dengan blanko. 4.2.1. Uji Kemampuan Nitrosomonas dalam Mengoksidasi Amonium pada Konsentrasi 250 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 Konsentrasi amonium yang terukur pada hari ke-0 berbeda-beda untuk tiap isolat dan nilainya lebih rendah dibandingkan dengan blanko. Besarnya konsentrasi amonium pada tiap interval waktu tersebut dapat dilihat pada Gambar 1. Konsentrasi amonium pada hari ke-0 berkisar antara 15,58-29,40 ppm N- (NH 4 ) 2 SO 4. Isolat yang memiliki konsentrasi amonium tertinggi pada hari ke-0 adalah NSkm3 (29,40 ppm) yang berasal dari tanah di bawah tumpukan kotoran kambing, sedangkan isolat dengan konsentrasi terendah yaitu isolat NSkm4 (15,58 ppm) yang juga berasal dari tanah di bawah tumpukan kotoran kambing. Perbedaan konsentrasi amonium yang mencolok ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan kemampuan isolat Nitrosomonas dalam mengoksidasi amonium meskipun berasal dari sumber yang sama.

23 (a) (b) Gambar 1. Konsentrasi amonium yang dioksidasi oleh Nitrosomonas dalam konsentrasi 250 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 oleh isolat: (a) NSsp1, NSkm1, NSm2, NSkb1, NSkm3, NSam, NSkb2; (b) NSsp2, NSsp3, NSsp4, NSsp5, NSkb2, NSsp6, NSkm4 Konsentrasi amonium mulai mengalami penurunan pada hari ke-4 dengan kisaran konsentrasi antara 13,07-19,77 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4, sedangkan isolat NSkm4 yang berasal dari sampel tanah di bawah tumpukan kotoran kambing, belum mengalami penurunan konsentrasi bahkan hingga hari ke-8. Konsentrasi amonium terus mengalami penurunan hingga hari ke-8, namun terdapat beberapa isolat yang mengalami peningkatan konsentrasi amonium, diantaranya adalah NSsp5, NSsp6, dan NSkm4. Peningkatan ini dapat saja terjadi karena sedang berada dalam fase di mana terdapat penambahan biomassa lain yang menyumbangkan amonium, sehingga amonium yang terukur pada hari ke-8

24 tersebut tidak murni berasal dari isolat Nitrosomonas. Konsentrasi amonium dari tiap sampel menurun hingga hari ke-12 dan secara umum meningkat pada hari ke-16. Peningkatan konsentrasi amonium pada hari ke-16 dapat disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya adalah aerasi (suplai oksigen). Kandungan oksigen yang rendah dapat menghambat oksidasi amonium, sehingga akan terjadi akumulasi amonium. Faktor lainnya adalah temperatur atau suhu karena seperti reaksi kimia pada umumnya, temperatur berpengaruh dalam laju degradasi oleh mikrob. Dalam keadaan lembab dan suhu tanah yang baik terjadi nitrifikasi pada kecepatan yang sangat cepat. Terdapat 2 isolat yang stabil menurunkan konsentrasi amonium sejak hari ke-0 hingga hari ke-16, yaitu isolat NSkm1 yang berasal dari sampel tanah di sekitar kandang kambing dan isolat NSsp2 yang berasal dari tanah di sekitar kandang sapi. Sedangkan isolat NSkm4 tergolong isolat Nitrosomonas yang memiliki kemampuan paling lambat, hal ini dikarenakan isolat ini baru mampu menurunkan konsentrasi amonium pada hari ke-12. Kemampuan isolat-isolat Nitrosomonas dalam mengoksidasi amonium dilihat dari besarnya rata-rata penurunan konsentrasi amonium (Tabel Lampiran 1). Dengan demikian, diperoleh 5 isolat yang memiliki kemampuan terbaik dalam menurunkan konsentrasi amonium. Isolat yang memiliki kemampuan terbaik berdasarkan urutan isolat yang mampu mengoksidasi amonium paling tinggi hingga terendah yaitu isolat NSkm3 (4,40 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ), NSsp2 (3,26 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ), NSam (2,95 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ), NSsp1 (2,94 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ), dan NSkb1 (2,83 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ). Dan secara umum, berdasarkan Gambar 1, terlihat bahwa masa produktif optimal isolat Nitrosomonas dalam 250 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 yaitu pada hari ke-4 hingga hari ke-12. 4.2.2. Uji Kemampuan Nitrosomonas dalam Mengoksidasi Amonium pada Konsentrasi 500 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 Konsentrasi amonium yang diperoleh dari hasil pengukuran hari ke-0 pada kultur yang diberikan 500 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 berkisar antara 38,70-59,64 ppm N- (NH 4 ) 2 SO 4. Hampir seluruh isolat mengalami penurunan konsentrasi amonium pada hari ke-4, kecuali isolat NSkm4 dengan konsentrasi yang masih sama seperti

25 pada hari ke-0 seperti halnya yang terjadi dalam konsentrasi 250 ppm (NH 4 ) 2 SO 4. Isolat yang mampu mengoksidasi amonium paling cepat sejak hari ke-0 hingga ke-4 adalah isolat NSsp1 yang berasal dari tanah di sekitar kandang sapi dengan penurunan konsentrasi sebesar 20,94 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4. Pada hari ke-8 semua isolat mengalami penurunan konsentrasi amonium, sedangkan hari ke-12 mengalami peningkatan, kecuali isolat NSkb2 yang masih menurun. Isolat ini merupakan isolat yang berasal dari tanah di sekitar kandang kerbau. Peningkatan tersebut dapat dilihat pada Gambar 2. Berdasarkan gambar tersebut, terlihat bahwa kemampuan optimal isolat Nitrosomonas dalam mengoksidasi amonium terjadi pada hari ke-4 hingga ke-8. Setelah mengalami peningkatan, isolat-isolat tersebut mengalami penurunan konsentrasi pada hari ke-16. Namun, terdapat isolat yang tetap mengalami peningkatan, yaitu isolat NSsp4, NSkb2, dan NSkm4. Ketiga isolat ini diduga telah memasuki fase jenuh, sehingga dengan adanya pengaruh aerasi dan temperatur maka terjadi akumulasi amonium. Isolat yang paling stabil dalam menurunkan konsentrasi nitrat adalah isolat NSkb2, sedangkan isolat NSkm4 merupakan isolat yang kemampuannya paling lambat seperti pada halnya di dalam 250 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 karena baru mampu menurunkan konsentrasi amonium pada hari ke-8. (a)

26 (b) Gambar 2. Konsentrasi amonium yang dioksidasi oleh Nitrosomonas dalam konsentrasi 500 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 oleh isolat: (a) NSsp1, NSkm1, NSkm2, NSkb1, NSkm3, NSam, NSkb2; (b) NSsp2, NSsp3, NSsp4, NSsp5, NSkb2, NSsp6, NSkm4 Terdapat 5 isolat yang mampu menurunkan konsentrasi amonium paling baik berdasarkan Tabel Lampiran 2. Secara berurutan dari isolat yang tercepat yaitu isolat NSsp1 dengan rata-rata penurunan konsentrasi amonium sebesar 8,96 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ; isolat NSkm2 dengan rata-rata penurunan konsentrasi 7,64 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ; isolat NSsp3 dengan rata-rata penurunan konsentrasi amonium 7,33 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ; isolat NSkm1 dengan rata-rata penurunan konsentrasi amonium sebesar 7,01 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ; dan isolat NSkm3 dengan rata-rata penurunan konsentrasi sebesar 6,91 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4. 4.2.3. Uji Kemampuan Nitrosomonas dalam Mengoksidasi Amonium pada Konsentrasi 1000 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 Konsentrasi amonium yang terukur pada hari ke-0 dalam 1000 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 berkisar antara 92,47-125,97 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4. Pada hari ke-4 dan ke-8, semua isolat mengalami penurunan konsentrasi amonium, namun terdapat 2 isolat yang tidak mengalami penurunan konsentrasi amonium pada hari ke-4, yaitu isolat Aam yang berasal dari tanah di sekitar kandang ayam dan isolat NSsp3 yang berasal dari tanah di sekitar kandang sapi. Konsentrasi keduanya baru mengalami penurunan pada hari ke-8, sehingga dapat dikatakan memiliki kemampuan yang relatif lambat dibandingkan dengan isolat lainnya. Seperti halnya dalam 500 ppm (NH 4 ) 2 SO 4, konsentrasi amonium dalam 1000 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 ini mengalami peningkatan pada hari ke-12 dan menurun kembali di hari ke-16 (Gambar 3).

27 Seperti pada variasi konsentrasi (NH 4 ) 2 SO 4 lainnya, diperoleh 5 isolat Nitrosomonas yang memiliki kemampuan mengoksidasi amonium paling baik (Tabel Lampiran 3), yaitu isolat isolat NSkb1 (23,71 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ), NSkm2 (21,87 ppm N-(NH 4 )2SO4), NSsp4 (21,19 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ), NSsp2 20,36 ppm (N-(NH 4 ) 2 SO 4 ), dan NSkm1 (20,19 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ). Isolat yang mengoksidasi amonium paling baik dalam 1000 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 adalah isolat NSkb1. (a) (b) Gambar 3. Konsentrasi amonium yang dioksidasi oleh Nitrosomonas dalam konsentrasi 1000 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 oleh isolat: (a) NSsp1, NSkm1, NSkm2, NSkb1, NSkm3,NSam, NSkb2; (b) NSsp2, NSsp3, NSsp4, NSsp5, NSkb2, NSsp6, NSkm4 4.3. Seleksi Nitrobacter sp. yang Memiliki Kemampuan Tinggi dalam Menghasilkan Nitrat Nitrobacter merupakan bakteri penitrifikasi yang berperan dalam mengoksidasi nitrit menjadi nitrat. Untuk itu, dilakukan pengukuran konsentrasi

28 nitrat yang mampu dihasilkan oleh Nitrobacter. Pengukuran ini dilakukan dengan menggunakan isolat yang berasal dari tanah di sekitar kandang ternak seperti halnya Nitrosomonas dengan variasi konsentrasi (NH 4 ) 2 SO 4 yang sama pula, yaitu 250 ppm, 500 ppm, dan 1000 ppm. Pengukuran konsentrasi nitrat dari tiap isolat pada hari ke-0 memiliki nilai yang bervariasi. Hal tersebut menunjukkan bahwa telah terbentuk nitrat pada awal pengukuran. Terbentuknya nitrat pada hari ke-0 ini disebabkan tiap isolat telah diinkubasi sebelumnya selama 48-72 jam, sehingga pada saat pengukuran telah terukur konsentrasi nitrat yang terbentuk pada masa inkubasi tersebut dan nilainya lebih tinggi dbandingkan dengan blanko. 4.3.1. Uji Kemampuan Nitrobacter dalam Menghasilkan Nitrat pada Konsentrasi 250 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 Variasi konsentrasi nitrat yang dihasilkan isolat-isolat Nitrobacter dalam konsentrasi 250 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 pada hari ke-0 berkisar antara 13,83-115,52 ppm N-NO 3, dimana konsentrasi nitrat tertinggi dihasilkan oleh isolat NBkm3 yang berasal dari tanah di sekitar kandang kambing. Pada hari ke-4, hampir seluruh isolat mengalami peningkatan konsentrasi nitrat, sedangkan pada hari ke-8 terdapat isolat yang mulai mengalami penurunan konsentrasi nitrat, yaitu isolat NBsp1, NBkm2, NBkb2, dan NBkm4. Bahkan untuk isolat NBsp2 dan NBsp4 dimana keduanya berasal dari tanah di sekitar kandang sapi, penurunan konsentrasi nitrat ini berlanjut terus hingga hari ke-16. Hal ini dapat disebabkan antara lain karena kemampuan kedua isolat Nitrobacter tersebut untuk mengoksidasi nitrit telah berkurang. Selain itu juga dapat dikarenakan ph media yang semakin menurun sehingga menekan populasi Nitrobacter. Penurunan nilai ph disebabkan proses nitrifikasi, yaitu pembentukan asam nitrat oleh bakteri nitrifikasi. Asam nitrat merupakan asam kuat, pembentukan asam nitrat akan menyebabkan penurunan nilai ph serta akan mengurangi aktivitas enzim (Cho et al., 2000 dalam Purnamasari, 2008). Konsentrasi nitrat pada hari ke-12 untuk isolat NBkm1, NBkm3, dan NBsp5 mulai menurun. Penurunan konsentrasi nitrat terjadi pada hari ke-16 untuk seluruh isolat Nitrobacter. Penurunan konsentrasi di hari ke-16 dapat disebabkan berkurangnya populasi Nitrobacter serta reduksi nitrat ke nitrit dan amonium dalam proses asimilasi nitrat. Selain itu dapat disebabkan oleh proses

29 penggunaan nitrat sebagai sumber oksigen (nitrat sebagai akseptor hidrogen). Dalam proses ini, oksigen digunakan oleh organisme bagi oksidasi senyawasenyawa karbon atau substansi anorganik, seperti misalnya sulfur. Dengan demikian, energi yang diperoleh digunakan untuk mereduksi nitrat ke nitrit, untuk membebaskan gas nitrogen, untuk mengoksidasi nitrogen atau ke amonia (Sutedjo et.al, 1991). (a) (b) Gambar 4. Konsentrasi nitrat yang dihasilkan oleh Nitrobacter dalam konsentrasi 250 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 oleh isolat: (a) NBsp1, NBkm1, NBkm2, NBkb1, NBkm3, NBam, NBkb2; (b) NBsp2, NBsp3, NBsp4, NBsp5, NBkb2, NBsp6, NBkm4 Variasi peningkatan konsentrasi nitrat ini dapat dilihat pada Gambar 4. Berdasarkan pengukuran terhadap konsentrasi nitrat dalam 250 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 juga diperoleh 5 isolat terbaik yang mampu meningkatkan konsentrasi nitrat

30 dalam interval waktu 0-16 hari. Isolat-isolat tersebut yaitu isolat NBkm1, NBkb1, NBsp6, NBkm4, dan NBkm2. Rata-rata peningkatan konsentasi masing-masing sebesar 3,91 ppm N-NO 3, 1,78 ppm N-NO 3, 1,70 ppm N-NO 3, 1,51 ppm N-NO 3, dan 1,07 ppm N-NO 3 (Tabel Lampiran 4). 4.3.2. Uji Kemampuan Nitrobacter dalam Menghasilkan Nitrat pada Konsentrasi 500 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 Variasi konsentrasi nitrat pada 500 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 yang terjadi saat hari ke-0 berkisar antara 20,56 ppm dengan rata-rata peningkatan sebesar 20,56-67,67 ppm N-NO 3. Isolat yang memiliki konsentrasi nitrat terendah yaitu isolat NBkm2, sedangkan isolat NBkm3 merupakan isolat dengan konsentrasi nitrat tertinggi. Kedua isolat tersebut berasal dari sampel tanah yang berada di bawah tumpukan kotoran kambing. Hal ini menunjukkan bahwa kedua isolat tersebut memiliki kemampuan berbeda dalam meningkatkan konsentrasi nitrat meskipun berasal dari sumber yang sama. Berdasarkan Gambar 5, terlihat bahwa secara umum peningkatan konsentrasi nitrat paling optimal yang dihasilkan isolat Nitrobacter dalam 500 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 terjadi sejak hari ke-4 hingga hari ke-12. Meskipun terdapat beberapa isolat yang mengalami penurunan pada hari ke-8, namun meningkat kembali di hari ke-12. Sedangkan pada hari ke-16, konsentrasi nitrat semua isolat menurun seperti halnya dalam konsentrasi 250 ppm (NH 4 ) 2 SO 4. Menurut Purnamasari (2008), hal ini dipengaruhi penurunan populasi bakteri, sehingga proses nitrifikasi oleh bakteri nitrifiers tidak optimal. Selain itu, penurunan nitrat juga disebabkan adanya reduksi nitrat yang bersifat asimilatif. Nitrat digunakan mikroorganisme sebagai sumber nitrogen untuk sintesis senyawa N-organik seperti protein, asam nukleat, dan dinding sel mikroba. Isolat-isolat Nitrobacter yang memiliki kemampuan meningkatkan konsentrasi nitrat paling baik dalam 500 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 sesuai urutan dari yang tertinggi hingga terendah adalah isolat NBsp5 dengan rata-rata peningkatan sebesar 2,56 ppm N-NO 3 ; isolat NBam dengan rata-rata peningkatan sebesar 1,33 ppm N-NO 3 ; isolat NBsp1 dengan rata-rata peningkatan sebesar 1,29 ppm N-NO 3 ; isolat NBkb1 dengan rata-rata peningkatan sebesar 0,36 ppm N-NO 3 ; dan isolat NBkm4 yaitu sebesar -0,02 ppm N-NO 3 (Tabel Lampiran 5). Nilai negatif

31 menunjukkan bahwa terjadi penurunan konsentrasi nitrat pada masa inkubasi tertentu, dalam hal ini isolat NBkm4 mengalami penurunan konsentrasi pada hari ke-8 dan ke-16. (a) (b) Gambar 5. Konsentrasi nitrat yang dihasilkan oleh Nitrobacter dalam konsentrasi 500 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 oleh isolat: (a) NBsp1, NBkm1, NBkm2, NBkb1, NBkm3, NBam, NBkb2; (b) NBsp2, NBsp3, NBsp4, NBsp5, NBkb2, NBsp6, NBkm4 4.3.3. Uji Kemampuan Nitrobacter dalam Menghasilkan Nitrat pada Konsentrasi 1000 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 Konsentrasi nitrat dalam 1000 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 cenderung menurun pada hari ke-8. Bahkan isolat NBkb2 yang berasal dari tanah di sekitar kandang kerbau, serta isolat NBsp2 dan NBsp4 yang berasal dari tanah di sekitar kandang sapi mengalami penurunan konsentrasi sejak hari ke-8 hingga ke-16. Hal ini dapat

32 dikarenakan ketiga isolat tersebut memiliki kemampuan yang rendah dalam mengoksidasi nitrit menjadi nitrat akibat konsentrasi (NH 4 ) 2 SO 4 yang diberikan terlalu tinggi. Selain itu, juga terjadi hal yang sebaliknya, yaitu asimilasi nitrat menjadi amonium. Hal tersebut dapat dilihat pada Tabel Lampiran 7 di mana pada hari ke-8 konsentrasi nitrat isolat NBkb2, NBsp2, dan NBsp4 tersebut menurun, sedangkan amoniumnya meningkat pada hari yang sama. Perubahan konsentrasi nitrat tiap interval waktu dapat dilihat pada Gambar 6. Isolat NBsp5, NBkb2, dan NBsp6 memiliki kemampuan yang relatif stabil karena mampu meningkatkan konsentrasi nitrat sejak hari ke-0 hingga hari ke-12. Sama halnya dengan isolat yang diberikan variasi (NH 4 ) 2 SO 4 lainnya, konsentrasi nitrat yang mampu dihasilkan isolat Nitrobacter pada hari ke-16 dalam 1000 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 ini mengalami penurunan. Kemampuan seluruh isolat untuk mengoksidasi nitrit menjadi nitrat dengan konsentrasi (NH 4 ) 2 SO 4 yang tinggi ini sangat tidak optimal. Rata-rata konsentrasi nitrat tiap interval waktu yang dihasilkan cenderung semakin rendah, sehingga secara umum diperoleh rata-rata peningkatan yang bernilai negatif. Namun begitu, dapat diperoleh 5 isolat dengan nilai rata-rata peningkatan konsentrasi tertinggi ataupun penurunan konsentrasi nitrat yang terkecil (Tabel Lampiran 6). Isolat-isolat tersebut antara lain isolat NBsp3 (1,29 ppm N-NO 3 ), NBkm2 (0,69 ppm N-NO 3 ), NBkm4 (-1,55 ppm N- NO 3 ), NBkb1 (-2,11 ppm N-NO 3 ), dan NBsp6 (-2,15 ppm N-NO 3 ). Peningkatan konsentrasi nitrat yang memiliki nilai negatif menunjukkan bahwa terjadi penurunan konsentrasi pada masa inkubasi tertentu. Hal ini sekaligus menunjukkan bahwa kemampuan isolat dalam menghasilkan nitrat pada konsentrasi 1000 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 ini tidak dapat optimal karena konsentrasi yang diberikan ini cukup tinggi. Isolat NBkb1 dan NBsp6 menunjukkan rata-rata peningkatan konsentrasi nitrat dengan nilai negatif. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan dari kedua isolat tersebut semakin lama semakin menurun, sehingga hasil pengukuran konsentrasi nitrat tiap interval waktu bukanlah meningkat, namun justru konsentrasi nitrat tersebut semakin menurun. Penurunan kemampuan dari kedua isolat ini dapat dipengaruhi oleh berkurangnya jumlah populasi Nitrobacter.

33 (a) (b) Gambar 6. Konsentrasi nitrat yang dihasilkan oleh Nitrobacter dalam konsentrasi 1000 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 oleh isolat: (a) NBsp1, NBkm1, NBkm2, NBkb1, NBkm3, NBam, NBkb2; (b) NBsp2, NBsp3, NBsp4, NBsp5, NBkb2, NBsp6, NBkm4 4.4. Pasangan-Pasangan Isolat Nitrosomonas dan Nitrobacter Unggul Berdasarkan hasil yang diperoleh dari tiap pengukuran konsentrasi amonium dan nitrat selama interval waktu hari ke-0 hingga ke-16, dapat dikatakan bahwa terdapat perbedaan kemampuan isolat Nitrosomonas dalam mengoksidasi amonium dan kemampuan isolat Nitrobacter dalam mengoksidasi nitrit menjadi nitrat untuk setiap perlakuan konsentrasi (NH 4 ) 2 SO 4. Dengan demikian dapat diperoleh isolat-isolat unggul yang dapat melakukan nitrifikasi dengan baik dibandingkan isolat lainnya. Dari masing-masing perlakuan tersebut, dipilih 5 isolat terbaik untuk masing-masing Nitrosomonas dan Nitrobacter.

34 Hasil penelitian Okabe et al., 1995, dalam Agustiyani et al., 2007, menunjukkan bahwa nitrifikasi sangat lambat dan tidak stabil walaupun jumlah bakteri nitrifikasi tinggi. Hal tersebut disebabkan di dalam sistem biofilm, populasi bakteri heterotropik mengkompetisi bakteri nitrifikasi dalam hal oksigen dan ruang yang menyebabkan terhambatnya proses nitrifikasi. Isolat Nitrosomonas yang paling cepat menurunkan konsentrasi amonium dalam 250 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 adalah isolat NSsp1, NSkb1, NSkm3, NSam, serta NSsp2 dan isolat Nitrobacter yang mampu meningkatkan konsentrasi nitrat paling baik adalah isolat NBkm1, NBkb1, NBsp6, NBkm4, dan NBkm2. Dari pasangan tersebut, isolat NSkb1-NBkb1 merupakan pasangan isolat yang mampu mengoksidasi amonium sekaligus menghasilkan nitrat dengan baik. Isolat Nitrosomonas terbaik dalam 500 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 adalah isolat NSsp1, NSkm1, NSkm2, NSkm3, dan NSsp3 serta isolat Nitrobacter terbaik adalah NBsp1, NBkb1, NBam, NBsp5, dan NBkm4. Berdasarkan pasangan yang diperoleh, isolat yang mampu melakukan nitrifikasi dengan baik adalah NSsp1- NBsp1. Sedangkan untuk 1000 ppm (NH 4 ) 2 SO 4, isolat terbaik adalah NSkm1, NSkm2, NSkb1, NSsp2, serta NSsp4 untuk Nitrosomonas dan isolat NBkm2, NBkb1, NBsp3, NBsp6, dan NBkm4 untuk Nitrobacter. Berdasarkan pasangan tersebut, pasangan isolat yang dapat melakukan proses nitrifikasi dengan baik adalah pasangan isolat NSkm2-NBkm2 dan NSkb1-NBkb1. Berdasarkan rata-rata penurunan konsentrasi amonium dan peningkatan konsentrasi nitrat, diperoleh bahwa baik isolat Nitrosomonas maupun Nitrobacter mampu melakukan nitrifikasi dengan baik pada pemberian 500 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 dalam kulturnya. Hal ini dikarenakan rata-rata penurunan amonium yang terjadi sebesar 0,21 ppm dan rata-rata peningkatan nitrat yang terjadi sebesar 60,90 ppm dibandingkan dengan kultur yang diberikan konsentrasi 250 ppm dan 1000 ppm (NH 4 ) 2 SO 4. Dengan demikian, pasangan isolat Nitrosomonas dan Nitrobacter yang memiliki kemampuan dan viabilitas paling baik yaitu isolat NSsp1, NSkm1, NSkm2, NSkm3, dan NSsp3 untuk Nitrosomonas serta isolat NBsp1, NBkb1, NBam, NBsp5, dan NBkm4 untuk Nitrobacter. Berdasarkan hasil yang telah diperoleh tersebut, dapat dikatakan bahwa setiap isolat Nitrosomonas maupun Nitrobacter memiliki kemampuan yang

35 berbeda antara isolat satu dengan isolat lainnya meskipun berasal dari sumber isolat yang sama. Secara umum sumber isolat yang memiliki Nitrosomonas dan Nitrobacter dengan kemampuan nitrifikasi paling optimal yaitu tanah yang berada di sekitar kandang kambing lebih baik dibandingkan dengan isolat yang berasal dari tanah di sekitar kandang kerbau, tanah di sekitar kandang sapi, maupun tanah di sekitar kandang ayam. 4.5. Konsentrasi Amonium dan Nitrat oleh Gabungan Pasangan Isolat Nitrosomonas dan Nitrobacter Unggul Sebanyak masing-masing 5 isolat Nitrosomonas dan Nitrobacter yang telah diperoleh dari hasil seleksi akan dikombinasikan untuk selanjutnya dilakukan pengukuran gabungan konsentrasi amonium dan nitrat. Isolat bakteri penitrifikasi hasil seleksi yang terbaik merupakan isolat-isolat dari media dengan konsentrasi (NH 4 ) 2 SO 4 sebesar 500 ppm. Sebanyak 5 isolat Nitrosomonas terbaik yang mampu menurunkan konsentrasi amonium dengan cepat digabungkan dengan 5 isolat Nitrobacter yang paling cepat dalam meningkatkan konsentrasi nitrat. Penggabungan isolat Nitrosomonas dan Nitrobacter ini dilakukan dengan memasukkan masing-masing sebanyak 2.5 ml kultur masing masing isolat ke dalam 50 ml media baru. Pasangan isolat gabungan ini dilakukan dengan mengkombinasikan satu isolat Nitrosomonas dengan lima isolat Nitrobacter, begitu seterusnya hingga kelima isolat Nitrosomonas tersebut dikombinasikan semua dengan kelima isolat Nitrobacter. Sehingga diperoleh 25 pasang isolat gabungan Nitrosomonas - Nitrobacter. Kemudian, masing-masing pasangan isolat gabungan tersebut diukur konsentrasi amonium dan nitratnya. Pengukuran ini dilakukan pada hari ke-4 karena secara umum aktivitas masing-masing isolat Nitrosomonas - Nitrobacter paling optimum terjadi pada hari ke-4. Hasil dari pengukuran konsentrasi amonium dan nitrat dari tiap pasangan isolat Nitrosomonas - Nitrobacter tersebut dapat dilihat pada Tabel 4. Berdasarkan tabel tersebut, diperoleh masing-masing 10 pasang isolat gabungan Nitrosomonas - Nitrobacter yang mampu mengoksidasi amonium dan meningkatkan nitrat dengan sangat baik. Pasangan isolat yang mampu menurunkan konsentrasi amonium dengan cepat yaitu pasangan isolat NSsp3-

36 NBkm4 (8,29 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ); NSkm3-NBkm4 (6,45 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ); NSsp1-NBkb1 (3,78 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ); NSsp1-NBsp1 (3.69 ppm N- (NH 4 ) 2 SO 4 ); NSsp1-NBm4 (3,69 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ); NSkm2-NBkm4 (3,69 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ); NSsp3-NBsp5 (3,69 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ); NSkm3-NBkb1 (3,59 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ); NSkm2-NBkb1 (2,76 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ); dan NSkm3- NBsp5 (1,84 ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ). Pasangan isolat yang mampu mengoksidasi amonium terbaik adalah pasangan isolat NSsp3-NBkm4 dan NSkm3-NBkm4. Pasangan isolat yang mampu meningkatkan konsentrasi nitrat terbaik antara lain pasangan isolat NSsp3-NBsp1 (12,82 ppm N-NO 3 ); NSkm2-NBsp1 (11,13 ppm N-NO 3 ); NSkm3-NBsp1 (6,07 ppm N-NO 3 ); NSkm3-NBam (6,07 ppm N-NO 3 ); NSsp3-NBam (4,81 ppm N-NO 3 ); NSsp3-NBsp5 (4,47 ppm N- NO 3 ); NSsp1-NBsp5 (4,39 ppm N-NO 3 ); NSkm2-NBkb1 (4,39 ppm N-NO 3 ); NSsp1-NBkm4 (3,96 ppm N-NO 3 ); dan NSkm3-NBkb1 (3,12 ppm N-NO 3 ). Pasangan isolat yang mampu meningkatkan nitrat dengan konsentrasi tertinggi adalah pasangan isolat NSkm2-NBsp1 dan NSsp3-NBsp1. Selain itu, diperoleh pula 5 pasangan isolat Nitrosomonas dan Nitrobacter yang mampu menurunkan konsentrasi amonium sekaligus meningkatkan konsentrasi nitrat dengan baik (baris yang berwarna abu-abu pada Tabel 4), yaitu pasangan isolat NSsp1-NBsp5, NSsp1-NBkm4, NSkm2-NBkb1, NSkm3-NBkb1, serta isolat NSsp3-NBsp5 (Tabel 4). Pasangan-pasangan isolat tersebut dapat dikatakan sebagai pasangan Nitrosomonas dan Nitrobacter yang mampu melakukan nitrifikasi paling baik, yaitu sampel yang mampu menurunkan konsentrasi amonium paling baik sekaligus meningkatkan konsentrasi nitrat paling baik pula. Berdasarkan Tabel 4, terdapat nilai konsentrasi amonium yang bernilai negatif. Konsentrasi bernilai negatif tersebut menunjukkan bahwa terjadi penurunan konsentrasi amonium dan sebaliknya untuk konsentrasi bernilai positif. Berbeda dengan konsentrasi amonium, pada konsentrasi nitrat diharapkan nilai yang sebaliknya, yaitu konsentrasi yang bernilai positif. Nilai konsentrasi yang positif tersebut menunjukkan terjadinya peningkatan konsentrasi nitrat, sedangkan nilai konsentrasi yang negatif menunjukkan hal yang sebaliknya.

37 Tabel 4. Konsentrasi Amonium dan Nitrat Isolat Gabungan Nitrosomonas Nitrobacter pada Hari Ke-4 dalam Konsentrasi 500 ppm (NH 4 ) 2 SO 4 Kode Isolat Penurunan Peningkatan Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi Amonium Nitrat Amonium Nitrat ----- ppm N-(NH 4 ) 2 SO 4 ----- ----- ppm N-NO 3 ----- Blanko 48.09 0.00 1.10 0.00 NSsp1-NBsp1 44.41-3.69 0.42-0.67 NSsp1-NBkb1 44.32-3.78 1.18 0.08 NSsp1-NBam 48.09 0.00-2.28-3.37 NSsp1-NBsp5 46.25-1.84 5.48 4.39 NSsp1-NBkm4 44.41-3.69 5.06 3.96 NSkm1-NBsp1 47.17-0.92-0.59-1.69 NSkm1-NBkb1 51.78 3.69 1.27 0.17 NSkm1-NBam 46.25-1.84 3.12 2.02 NSkm1-NBsp5 55.46 7.37-0.42-1.52 NSkm1-NBkm4 53.62 5.53 3.80 2.70 NSkm2-NBsp1 50.86 2.76 12.23 11.13 NSkm2-NBkb1 45.33-2.76 5.48 4.39 NSkm2-NBam 48.09 0.00 3.80 2.70 NSkm2-NBsp5 53.71 5.62-1.69-2.78 NSkm2-NBkm4 44.41-3.69 2.95 1.86 NSkm3-NBsp1 50.77 2.67 7.17 6.07 NSkm3-NBkb1 44.50-3.59 4.22 3.12 NSkm3-NBam 60.07 11.98 7.17 6.07 NSkm3-NBsp5 46.25-1.84-2.28-3.37 NSkm3-NBkm4 41.64-6.45-1.27-2.36 NSsp3-NBsp1 49.94 1.84 13.92 12.82 NSsp3-NBkb1 53.62 5.53 3.37 2.28 NSsp3-NBam 58.23 10.13 5.90 4.81 NSsp3-NBsp5 44.41-3.69 5.57 4.47 NSsp3-NBkm4 39.80-8.29 2.36 1.27