BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Jenis penelitian Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian dasar dengan metode penelitian deskriptif. 3.2 Objek Penelitian Tujuh puluh tiga kultivar mangga (Mangifera indica) yang digunakan dalam penelitian ini dikoleksi dari kebun Cukurgondang Balai Penelitian Tanaman dan Buah di Pasuruan, Jawa Timur. Sampel mangga yang digunakan adalah hasil persilangan mangga AR 143 dengan varietas mangga merah dan induknya. 3.3 Lokasi dan Waktu Penelitian 3.3.1 Lokasi Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Sekolah Ilmu Teknolodi Hayati, Institut Teknologi Bandung. 3.3.2 Waktu Penelitian Prapenelitian dilakukan selama dua bulan, dimulai dari bulan Juli 2009 sampai bulan September 2009. Selanjutnya penelitian dilakukan selama empat bulan, dimulai dari bulan Oktober 2009 sampai bulan Januari 2010. 28
29 3.4 Alat dan Bahan 3.4.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 3.1. Tabel 3.1 Alat yang digunakan dalam penelitian ini No. Alat 1. Autoklaf 2. Lumpang Alu 3. Timbangan digital 4. Alat Sonikasi 5. Vorteks 6. Thermocyler 7. Mikrosenrifuga 8. UV-transilluminator 9. Spektrofotometer 10. Horizontal elektroforesis 11. Oven 12. Waterbath 13. Waterpass 14. Mikropipet + Tips 15. Botor Duran 50, 100, 250, 500 dan 1000 ml 16. Tabung Mikrosentrifuga 1,5 ml 17. Lemari Es 3.4.2 Bahan Tabel 3.2. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 3.2 Bahan yang digunakan dalam penelitian ini No Bahan 1. Daun mangga (Mangifera indica) 2. Nitrogen cair
30 Lanjutan Tabel 3.2 No. Bahan 3. Buffer ekstraksi (CTAB, Tris HCl, NaCl, EDTA, β-mercapthanol) 4. TE buffer 5. Ethanol absolute 6. Polyvinilpyrrolidone (PVP) 7. CIAA (kloroform isoamil alkohol) 8. 5X Colorless Buffer 9. MgCl 2 10. dntps mix 10mM 11. Primer forward-reverse mikrosatelit 12. Taq polimerasi 13. 6-FAM flourecent 200 nmole 14. DNA template 15. 1 kb DNA ladder 16. Loading dye 17. Alkohol 70% 18. Asam asetat glacial 19. Gel agarosa 10 Es batu 11. TAE 1X 12. Ethidium Bromide (EtBr) 13. Deion water 3.5 Cara Kerja 3.5.1 Persiapan alat dan bahan Sebelum melakukan penelitian, alat dan bahan yang diperlukan dipersiapkan di Laboratorium Genetika Sekolah Ilmu Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung. Alat seperti tabung mikrosentrifuga 1,5 ml, tabung PCR, tips, botol Duran, dan beberapa bahan yang harus disterilkan terlebih dahulu sebeluum digunakan. Bahan-bahan untuk untuk isolasi DNA disiapkan dan disimpan dalam suhu ruangan, di dalam lemari es (4 o C), di
31 dalam freezer ( 20 o C) dan ( 80 o C), sedangkan semua bahan untuk PCR disimpan dalam freezer ( 20 o C). Sampel induk mangga dalam penelitian ini merupakan jenis varietas mangga Arumanis dan mangga merah (Tabel 3.3) yang disilangkan dan menghasilkan 63 turunan F1 (Tabel 3.4). Tabel 3.3 Sampel induk mangga yang digunakan dalam penelitian No. Nama individu Jenis varietas 1 AR 143 Mangga Arumanis 2 Apel Mangga Merah 3 Delima Mangga Merah 4 Gedong Gincu Mangga Merah 5 Haden Mangga Merah 6 Irwin Mangga Merah 7 Keith Mangga Merah 8 Krisapati Maldah Mangga Merah 9 Liar Mangga Merah 10 Saigon Mangga Merah Tabel 3.4 Sampel mangga turunan F1 yang digunakan dalam penelitian No. Nama Individu Induk 1. F1-1 Haden x AR 143 2. F1-2 Haden x AR 143 3. F1-3 Apel x AR 143 4. F1-7 AR 143 x Apel 5. F1-8 Irwin x AR 143 6. F1-9 Irwin x AR 143 7. F1-10 Irwin x AR 143 8. F1-11 Haden x AR 143 9. F1-13 Apel x AR 143 10. F1-14 Irwin x AR 143 11. F1-15 AR 143 x Haden 12. F1-16 AR 143 x Kirsapati Maldah 13. F1-18 AR 143 x Gedong Gincu 14. F1-19 Manalagi x Haden
32 Lanjutan Tabel 3.4 No. Nama Individu Induk 15. F1-21 AR 143 x Haden 16. F1-22 AR 143 x Irwin 17. F1-23 Apel x Manalagi 18. F1-25 AR 143 x Delima 19. F1-26 AR 143 x Haden 20. F1-27 AR 143 x Haden 21. F1-28 AR 143 x Kirsapati Maldah 22. F1-29 Irwin x AR 143 23. F1-30 Haden x AR 143 24. F1-31 Irwin x AR 143 25. F1-33 AR 143 x Gedong Gincu 26. F1-35 AR 143 x Irwin 27. F1-36 Irwin x AR 143 28. F1-37 Apel x AR 143 29. F1-38 Apel x AR 143 30. F1-39 Apel x AR 143 31. F1-41 Apel x AR 143 32. F1-42 Haden x AR 143 33. F1-43 Irwin x AR 143 34. F1-44 AR 143 x Liar 35. F1-45 AR 143 x Saigon 36. F1-46 AR 143 x Haden 37. F1-47 AR 143 x Liar 38. F1-48 Keith x AR 143 39. F1-49 AR 143 x Saigon 40. F1-50 AR 143 x Liar 41. F1-51 AR 143 x Delima 42. F1-52 AR 143 x Keith 43. F1-53 AR 143 x Saigon 44. F1-54 AR 143 x Keith 45. F1-55 Apel x AR 143 46. F1-59 AR 143 x Gedong Gincu 47. F1-61 AR 143 x Gedong Gincu 48. F1-62 AR 143 x Gedong Gincu 49. F1-65 AR 143 x Gedong Gincu
33 Lanjutan Tabel 3.4 No. Nama Individu Induk 50. F1-66 AR 143 x Gedong Gincu 51. F1-67 AR 143 x Gedong Gincu 52. F1-68 AR 143 x Keith 53. F1-69 AR 143 x Irwin 54. F1-72 AR 143 x Kartikia 55. F1-73 AR 143 x Gedong Gincu 56. F1-77 AR 143 x Podang 57. F1-82 AR 143 x Gedong Gincu 58. F1-83 AR 143 x Gedong Gincu 59. F1-85 AR 143 x Gedong Gincu 60. F1-86 AR 143 x Haden 61. F1-87 AR 143 x Gedong Gincu 62. F1-88 AR 143 x Haden 63. F1-94 AR 143 x Haden 3.5.2 Pra penelitian Pada tahap pra penelitian, dilakukan pengambilan sampel, optimasi isolasi DNA dan perancangan primer. Sampel diambil dari kebun Cukurgondang di Jawa Timur. Sampel daun mangga dikirimkan dalam bentuk berat kering dan ditambahkan silica gel agar sampel tidak rusak. Selanjutnya dilakukan optimasi Isolasi DNA untuk mencari metode yang tepat. Masing-masing 73 sampel DNA mangga diamplifikasi dengan menggunakan primer yang didesain menggunakan program primer 3 dan DNA calculator. Primer ini didesain dengan mengoleksi 139 motif mikrosatelit yang dikoleksi dari GeneBank, kemudian diolah dengan software Primer3 dan dihitung kecocokannya dengan menggunakan software DNA calculator sehingga didapatkan empat pasangan primer (Tabel 3.5).
34 Selanjutnya pada tahap pra penelitian juga dilakukan percobaan isolasi DNA mangga untuk mencari metode yang tepat untuk mengisolasi DNA mangga.
Tabel 3.5 Primer yang digunakan dalam proses amplifikasi DNA mangga. No Nama Primer No. Aksesi Gene Bank Motif Mikrosatelit Jenis primer Urutan Basa Primer (5 3 ) P.Basa Tm( o C) %GC Product Size Tipe Mikrosatelit 1. 2. 3. MiM 1.1 EU421196 MiM 4.2 EU421198 MiM 2.4 EU421186 (GA)5(A)7 Forward 5 tgtaaaacgacggccagtccgattagcaaaccacttc3 37bp 55.8 47.4 % 250 bp Campuran Reverse 5 GGATTAGCTAGCCTCGAGTT3 20 bp 55.5 50.0 % (CT)11(T)12 Forward 5 tgtaaaacgacggccagtgagcttaggcatgttttacc3 38 bp 54.2 45.0 % 221 bp Campuran Reverse 5 TTACTCACTGTCAACGCAAG3 20 bp 55.0 45.0 % (A)9 Forward 5 tgtaaaacgacggccagtttctgtattcttccgtcacc3 38 bp 55.2 45.0 % 112 bp Mono Reverse 5 CTTGCCTGCTCTTACTTGTT3 20 bp 55.0 45.0 % 4. MiM 4.4 AY942819 (AAC)8 Forward 5 tgtaaaacgacggccagtacttttcttccactgctcct3 38 bp 55.7 45.0 % 183 bp Tri Reverse 5 CAAGTACCTGCTGCAACTAGA3 21 bp 55.9 47.6 % Keterangan: warna merah menunjukkan urutan basa primer forward yang akan berikatan dengan primer universal (FAM) 35
3.5.3 Isolasi DNA DNA mangga diisolasi dengan menggunakan Metode Doyle & Doyle, 1990 (Annisa, 2005). Proses pertama tahap isolasi DNA mangga yaitu menggerus 0,5 gr sampel daun (berat kering) hingga halus menggunakan lumpang alu. Nitrogen cair ditambahkan untuk mempermudah penggerusan sampel daun mangga. Hasil gerusan tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga ukuran 1,5 ml. Setelah itu secara berturut-turut ditambahkan 800 µl buffer CTAB 2% (60 o C) dan 5 mg PVP, kemudian diinkubasi pada suhu 60 o C selama 25 menit, lalu diamkan pada suhu ruang. Selanjutnya ditambahkan Chloroform:Isoamilalkohol (24:1) dengan volume sama dengan volume campuran sebelumnya, lalu dihomogenkan. Kemudian campuran tersebut disentrifugasi pada kecepatan 8300 rpm selama 15 menit hingga didapat supernatantnya. Supernatant dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifuga baru dan ditambahkan 0,5 M NaCl dengan volume sama dengan campuran sebelumnya, lalu dihomogenkan. Selanjutnya ditambahkan ETOH absolut dua kali volume campuran sebelumnya, lalu dihomogenkan. Kemudian campuran diinkubasi pada suhu -80 o C selama 30 menit. Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 3 menit dan 6000 rpm selama 3 menit sehingga didapat pelet di dasar tabung. Pelet selanjutnya dicuci dengan ETOH 70 % (50 ml), lalu ethanol dibuang dengan hati hati dan dikeringkan. Selanjutnya ditambah TE sebanyak 50 ml dan disimpan dalam freezer (-20 o C). 36
37 3.5.4 Karakterisasi DNA hasil isolasi Setelah dilakukan isolasi terhadap DNA mangga, selanjutnya dilakukan karakterisasi secara kualitatif hasil isolasi DNA mangga tersebut dengan cara elektroforesis. Sampel DNA dicampurkan dengan loading dye dengan perbandingan 5:1 (v/v). Campuran tersebut dimasukkan dengan hatihati ke dalam sumur-sumur yang ada pada gel agarosa. Selain itu, dimasukkan pula marker 1kb DNA Ladder sebanyak 5 µl. Sampel DNA dielektroforesis pada gel agarosa 0,8% dalam buffer TAE 1x (Buffer TAE 50x diencerkan dengan aquades dengan perbandingan 1:49 v/v) selama 30 menit pada tegangan 100 volt. Setelah selesai elektroforesis, pewarnaan DNA dilakukan dengan cara merendam gel agarosa pada larutan ethidium bromida (10 µg/ml) selama dua menit kemudian dibilas dengan aquades selama enam menit. Selanjutnya gel diamati pada UV-Transiluminator dan didokumentasikan menggunakan kamera digital. 3.5.5 Mengukur Konsentrasi DNA Sebelum digunakan sebagai template untuk proses amplifikasi, sampel DNA yang telah diisolasi selanjutnya diukur konsentrasi DNA-nya menggunakan alat spektrofotometer sehingga dapat diketahui konsentrasi DNA yang terkandung dalam masing-masing sampel. Selanjutnya semua sampel diencerkan dengan TE hingga konsentrasi DNA-nya 100 ng/µl. sedangkan sampel yang konsentrasi DNA-nya kurang dari 100ng/µL tidak perlu diencerkan.
38 3.5.6 Amplifikasi DNA menggunakan Penanda Mikrosatelit Amplifikasi sampel DNA mangga pada penelitian ini dilakukan dengan metode Touch-Down PCR berdasarkan Rahman et al. (2000). Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer mikrosatelit yang telah didesain. DNA selanjutnya diamplifikasi melalui proses PCR dengan komposisi reaksi berdasarkan penelitian sebelumnya (Annisa, 2005). Komposisi reaksi amplifikasi dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 3.6. No. Tabel 3.6 Komposisi Reaksi Amplifikasi Bahan Konsentrasi awal Konsentrasi akhir Volume reaksi(µl) 1. 5x Colorless buffer - 1X 4 2. MgCl 2 25 mm 2mM 2 3. dntps 10 mm 0,2 mm 0,4 4. Primer Forward 10 mm 0,5 mm 0,4 5. Primer Reverse 10 mm 1 mm 2 6. FAM 10 mm 1 mm 2 7. Go Taq Polimerase 5 u/µl 1,25 unit 0,2 8. DNA template - 50 ng 1,0 9. Air Deion steril - - 8 10. Total volume 20 Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan 4 primer yang telah didesain pada saat pra penelitian. Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan alat thermocycler yang diprogram untuk melaksanakan beberapa kondisi. Proses amplifikasi ini diawali dengan tahap denaturasi awal selama tiga menit pada suhu 94 o C diikuti dengan dua siklus denaturasi pada suhu 94 o C selama 30 detik, tahap penempelan primer pada DNA templat (annealing) 56-47 o C (sesuai temperature annealing primer) selama 30 detik,
39 dan tahap pembentukan kopi DNA templat yang diawali dari daerah primer (extension) pada suhu 72 o C selama 30 detik; kemudian diikuti 18 siklus masing-masing 15 detik pada suhu 94 o C selama 30 detik, 56-47 o C (sesuai Ta primer) selama 15 detik dengan penurunan suhu 0,5 o C tiap siklusnya dan 72 o C selama 15 detik; selanjutnya diikuti 27 siklus pada suhu 94 o C selama 30 detik, 53 o C selama 45 detik dan 72 o C selama 45 detik; diikuti dengan tahap ekstensi akhir pada suhu 72 o C selama 10 menit. DNA yang telah diperbanyak melalui proses Amplifikasi selanjutnya dielektroforesis pada gel agarosa 2%. 3.5.7 Elektroforesis DNA hasil PCR DNA yang telah diperbanyak melalui proses amplifikasi (PCR) selanjutnya dielektroforesis untuk melihat kehadiran larik DNA yang telah teramplifikasi. Elektroforesis ini dilakukan pada gel agarosa 2% dalam 0,5x buffer TAE. Sebelum dimasukkan ke dalam sumur gel, DNA sampel dicampurkan dengan loading dye dengan perbandingan 5:1 (v/v). DNA marker yang digunakan adalah 1 kb DNA ladder. Campuran tersebut dielektroforesis selama 1 jam pada tegangan 120 volt. Pewarnaan gel agarosa dilakukan dengan merendam gel dalam larutan ethidium bromide selama 15 menit. Kemudian gel agarosa dicuci dengan akuadest selama 1 menit. Selanjutnya gel dikeringkan dengan posisi vertikal lalu diamati dengan alat UV translluminator hingga terlihat pita DNA yang berukuran 100-250 pb (lebih rendah dibandingkan basa terendah pada Ladder 1 kb DNA), lalu didokumentasikan.
40 3.5.8 Sekuensing Hasil amplifikasi 73 sampel mangga menggunakan 4 primer dimasukan ke dalam plat khusus sekuensing yang masing-masing plat memiliki 96 well. Dalam satu well dimasukkan masing-masing 20 µl sampel yang telah diamplifikasi. Plat ditutup dengan menggunakan cap tube dan sill khusus sekuensing sehingga setiap well tertutup dengan baik. Selanjutnya plat dikemas dalam black box dan dikirimkan ke Macrogen Korea untuk disekuensing. Visualisasi hasil amplifikasi DNA mangga dilakukan dengan mengirimkan hasil amplifikasi dengan primer yang diberi ekor penanda fluoresens 6-FAM ke Macrogen Korea untuk disekuensing dengan ABI Prisma automatic DNA sekuenser. 3.6 Analisis Data Analisis data dilakukan berdasarkan hasil sekuensing. Hasil sekuensing yang diolah dengan program Genemarker akan menunjukan puncak pendaran alel-alel mikrosatelit. Selanjutnya data diinpretasikan dalam bentuk data matriks biner. Angka satu (1) untuk kehadiran puncak mikrosatelit dan angka nol (0) untuk ketidakhadiran puncak mikrosatelit. Pemilihan puncak alel mikrosatelit dilakukan dengan memilih dua alel yang memiliki score dan height tertinggi. Analisis yang kemudian dilakukan adalah perhitungan total alel yang diperoleh per lokus dan menentukan nilai PIC dengan rumus (Botstein, 1980): PIC = 1 pi 2 ( pi 2 ) 2 + pi 2, dimana P i = frekuensi dari alel-alel ke-i. Selain itu juga diperoleh nilai Expected Heterozygosity (He) dan Observed Heterozygosity (Ho)
41 berdasarkan perhitungan dilakukan dengan menggunakan bantuan program GeneMarker dan Cervus 3.03. Selanjutnya dilakukan analisis Pricipal Coordinate Analysis (PCO) berdasarkan jarak genetik untuk melihat kekerabatan 73 sampel mangga dari empat primer tersebut dengan menggunakan program GeneAlex 6.3. 3.6 Alur Penelitian Pengambilan sampel daun mangga Persiapan alat dan bahan Isolasi DNA mangga dan karakterisasi Pra penelitian DNA dengan elekroforesis gel agarosa Menghitung konsentrasi DNA dan mengencerkan sampel Amplifikasi, Elekktroforesis, dan Sekuensing Analisis Data Kesimpulan Gambar 3.1 Alur Penelitian