Hasnah Lidiawati. 062112706. 2015. Optimasi Fase Gerak pada penetapan kadar campuran dextromethorphane HBr dan diphenhydramine HCl dalam sirup dengan metode HPLC. Dibimbing Oleh Drs. Husain Nashrianto, M.S dan Ade Heri Mulyati, M.Si. RINGKASAN Campuran dextromethorphane HBr dan diphenhydramine HCl merupakan salah satu jenis kombinasi dalam formula sediaan sirup. Jumlah sampel yang banyak dapat menyebabkan terjadinya keterlambatan dalam analisis, beberapa strategi untuk mempercepat proses analisis beberapa zat aktif diantaranya analisis secara bersamaan dalam satu analisis secara simultan. Dalam analisis zat aktif secara simultan diperlukan optimasi fase gerak dan laju alir sehingga diperoleh kondisi yang optimal. Tujuan penelitian ini untuk menentukan perbandingan fase gerak dan laju alir yang diperlukan agar diperoleh kondisi yang optimal dalam analisis campuran dextromethorphane HBr dan diphenhydramine HCl dalam sirup dengan metode HPLC. Penelitian dilakukan dengan menggunakan kolom Waters Sunfire C 8 (4,6 mm x 250 mm, 5µm) dengan panjang gelombang 220 nm yang sebelumnya dilakukan pendahuluan yaitu penentuan panjang gelombang maksimum dari Dextromethorphan HBr dan Diphenhydramine HCl dalam sirup dengan menggunakan metode spektrofotometri. Kemudian dilakukan uji kesesuaian sistem dengan cara memodifikasi perbandingan fase (30:70), (35:65), (38:62), dan (40:60) dengan laju alir yang berbeda pada satu komposisi fase gerak yaitu 1,0 ml/menit, 1,2 ml/menit, dan 1,4 ml/menit dengan parameter resolusi, simpangan baku relatif (SBR), tailing factor yang memenuhi persyaratan. Kemudian dilakukan uji validasi pada metode dengan parameter presisi, akurasi, dan linearitas. Berdasarkan hasil uji kesesuaian sistem didapatkan kondisi yang optimal dalam komposisi fase gerak Acetonitril : TFA 0,1% dengan perbandingan (30:70) dan laju alir 1,4 ml/menit dengan resolusi sebesar 3,157 dengan persyaratan 2,5. Setelah dilakukan uji validasi didapat hasil pengujian linearitas dengan koefisien korelasi (r) Dextromethorphan HBr sebesar 0,9999, dan Diphenhydramine HCl sebesar 0,9999 dengan persyaratan r 0,9980, pengujian akurasi menunjukkan rata-rata % recovery Dextromethorphan HBr sebesar 100,665 % dan Diphenhydramine HCl sebesar 100.901 %, pengujian presisi dan diperoleh hasil RSD Dextromethorphane HBr sebesar 1,2 % dan Diphenhydramine HCl sebesar 0,4 %. Kata kunci : Optimasi; Fase Gerak; Campuran dalam Sirup; HPLC 1
I. Pendahuluan Kromatografi cair kinerja tinggi mempunyai kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif. Dengan teknologi ini, kromatografi cair dapat menghasilkan pemisahan yang cepat dalam banyak hal, dengan keunggulan zat-zat yang tidak menguap atau tidak tahan panas, tanpa penguraian atau tanpa perlu membuat yang dapat menguap. Disamping itu, komposisi fase gerak berpengaruh nyata terhadap kinerja kromatografi dan harus dikendalikan dengan cermat (Depkes RI, 1995). Penelitian sebelumnya pemisahan dextromethorphane HBr dan diphenhydramine HCl dalam sirup dapat ditentukan dengan menggunakan perbandingan fase trifluoro asetat (TFA) 0,1 % sebanyak (38:62) dengan jenis kolom Water Atlantis dc 18 (4,6 mm x 150 mm, 5µm) dengan panjang gelombang 220 nm, dengan laju alir 1,0 ml/menit. Daya pemisah (resolusi) yang didapat yaitu 1,5. (Muhamad Faisal Fuad, 2012). Berdasarkan penelitian sebelumnya, peneliti melakukan penetapan kadar dextromethophan HBr dan diphenhydramine HCl dalam sirup dengan cara memodifikasi perbandingan fase gerak dan laju alir untuk mendapatkan kondisi yang optimal dalam analisis. Penelitian dilakukan dengan jenis kolom Waters Sunfire C 8 (4,6 mm x 250 mm, 5µm) dengan panjang gelombang 220 nm yang sebelumnya akan dilakukan uji kesesuaian sistem dengan cara memodifikasi perbandingan fase (30:70), (35:65), (38:62), dan (40:60) dengan laju alir yang berbeda pada satu komposisi fase gerak yaitu 1,0 ml/menit, 1,2 ml/menit, dan 1,4 ml/menit dengan parameter resolusi, simpangan relatif deviasi, dan tailing faktor. Pengujian kesesuaian sistem dilakukan untuk mengetahui apakah alat, metode dan sistem HPLC yang digunakan dapat memberikan hasil yang baik dalam proses analisis. Kemudian akan dilakukan uji validasi pada metode. II. Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dengan tiga tahap yaitu uji identifikasi Diphenhydramien HCl dan Dextrometrophan HBr dengan cara memodifikasi perbandingan fase (30:70), (35:65), (38:62), dan (40:60), uji kesesuaian sistem dengan cara memodifikasi perbandingan fase (30:70), (35:65), (38:62), dan (40:60) dengan laju alir yang berbeda pada satu komposisi fase gerak yaitu 1,0 ml/menit, 1,2 ml/menit, dan 1,4 ml/menit dengan parameter resolusi, simpangan relatif deviasi, dan tailing faktor. Pengujian kesesuaian sistem dilakukan untuk mengetahui apakah alat, metode dan sistem HPLC yang digunakan dapat memberikan hasil yang baik dalam proses analisis. Kemudian akan dilakukan uji validasi pada metode dengan parameter presisi, akurasi, dan linearitas. 2
Metode Kerja Kondisi HPLC Kolom : Waters Sunfire C 8 (4,6 mm x 250 mm, 5µm) Detektor : UV-220 nm Volume injek : 20 µl Syarat kesesuaian sistem Laboratorium QC kimia-fisika PT.Harsen: Relatif Standar Deviasi(RSD) 2,0% Lempeng Teoritis (n) 750 Tailing 2,0 Resolusi 2,5 Fase Gerak : Dicampurkan asetonitril dengan asam trifluoro asetat 0,1 % dengan perbandingan fase gerak (30:70), (35:65), (38:62), dan (40:60) kemudian homogenkan, saring dengan menggunakan penyaring berukuran 0,45 µm dan disonikasi selama 30 menit. Uji Kesesuaian Sistem HPLC Ditimbang sebanyak 54,0 mg sebanyak 40,0 mg Dextromethorphane HBr. Dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 ml, dilarutkan dan encerkan dengan aquades hingga tanda batas. Dipipet sebanyak 10,0 ml larutan dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 ml encerkan dengan aquades hingga tanda batas, dihomogenkan. Kemudian disonikasi 10 menit dan saring dengan filter 0,25 µm. Diphenhydramine HCl konsetrasi 216 µg/ml dan Dextromethorphan HBr 160 µg/ml. Kemudian disuntikkan ke dalam sistem HPLC dengan volume penyuntikan 20 µl pada kondisi HPLC menggunakan perbandingan fase gerak asetonitril dengan asam trifluoro asetat (TFA) 0,1 % yaitu (30:70), (35:65), (38:62), dan (40:60) dengan laju alir yang berbeda pada satu komposisi fase gerak yaitu 1,0 ml/menit, 1,2 ml/menit, dan 1,4 ml/menit. Kemudian parameter kesesuaian sistemnya yang meliputi resolusi (daya pisah), RSD, lempeng teoritis dan faktor asimetri puncak. Uji identifikasi Uji identifikasi terhadap Dextromethorphane HBr dilakukan dengan membandingkan waktu retensi atau waktu tambat baku Dextromethorphane HBr terhadap waktu retensi larutan sampel, diukur pada panjang gelombang 220 nm. Untuk mengetahui peak Dextromethorphane HBr perlu dilakukannya penginjekkan masingmasing baku tunggal. Kemudian disuntikkan ke dalam system HPLC dengan volume 20 µl pada kondisi HPLC menggunakan fase gerak asetonitril dengan asam trifluoro asetat (TFA) 0,1 % yaitu (30:70), (35:65), (38:62), dan (40:60). Uji Validasi Linearitas Dipipet sampel sirup dengan konsentrasi campuran 25%, 50%, 100%, 150% dan 200%. Encerkan dengan aquades hingga tanda batas, dihomogenkan dan saring dengan menggunakan filter 0,45µm. Konsentrasi Diphenhydramine HCl yaitu 54 ppm, 108 ppm, 216 ppm, 324 ppm, 432 ppm dan konsentrasi Dextromethorphan HBr yaitu 40 ppm, 80 ppm, 160 ppm, 240 ppm, 320 ppm. Kemudian disuntikkan ke dalam sistem HPLC dengan volume penyuntikan 20 µl pada kondisi HPLC menggunakan fase gerak yang 3
telah memenuhi syarat kesesuaian sistem. Akurasi Dipipet sejumlah sampel sirup dengan konsentasi 50%, 100%, dan 150% masing-masing sebanyak 3 kali. Encerkan dengan aquades hingga tanda batas, dihomogenkan dan saring dengan menggunakan filter 0,45µm. Kemudian disuntikkan ke dalam sistem HPLC dengan volume penyuntikan 20 µl pada kondisi HPLC menggunakan fase gerak yang telah memenuhi syarat kesesuaian system. Dihitung %recovery dan simpangan baku relatif. Kriteria penerimaan %recovery 98,0%-102%. Presisi Dipipet 10,0 ml sampel sirup dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 ml, dilarutkan dengan aquades hingga tanda batas. Kemudian disonikasi 10 menit dan saring dengan filter 0,25 µm. Dipipet 2,0 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 ml larutkan dengan aquades hingga tanda batas, dihomogenkan. Pengulangan sebanyak 6 kali. Kemudian disuntikkan ke dalam sistem HPLC dengan volume penyuntikan 20 µl pada kondisi HPLC menggunakan fase gerak yang telah memenuhi syarat kesesuaian sistem. Masing-masing dilakukan disuntikkan sebanyak 1 kali sebagai persyaratan presisi. III. Hasil dan Pembahasan Optimasi dilakukan dengan menyuntikkan larutan Diphenhydramine HCl konsentrasi 216 µg/ml dan Dextromethorphan HBr dengan konsentrasi 160 µg/ml kedalam sistem HPLC dengan perbandingan fase gerak asetonitril dengan asam trifluoro asetat (TFA) 0,1 % yaitu (30:70), (35:65), (38:62), dan (40:60). Pada uji fase gerak ini dengan komposisi fase gerak asetonitril dengan asam trifluoroasetat (TFA) 0,1 % (30:70) terjadi pemisahan Dextromethorphan HBr dan Diphenhydramine HCl terpisah secara sempurna. Hasil resolusi yang memenuhi syarat PT Harsen 2,5 adalah komposisi fase (30:70). Nilai resolusi yang rendah menunjukkan bahwa dextromethorphan HBr tidak terpisah sempurna hal ini disebabkan karena penambahan pelarut organik (asetonitril) pada komposisi yang lain terlalu banyak menyebabkan penurunan tingkat kepolaran fase gerak sehingga sampel berinteraksi kuat dengan fase gerak dan terelusi cepat. Dari data kesesuaian sistem pada tabel diatas menujukkan bahwa campuran Dextromethorphan HBr dan Diphenhydramine HCl dengan menggunakan komposisi fase gerak asetonitril : TFA 0,1% (30:70) dengan laju alir 1,4 ml/menit memiliki waktu retensi lebih cepat dari laju alir yang lain. Pada laju alir 1,4 ml/menit memiliki nilai resolusi, faktor asimetris dan simpangan baku relatif yang memenuhi persyaratan tempat dilakukannya penelitian. Penurunan nilai lempeng teoritis pada laju alir 1,4 ml/menit disebabkan karena interaksi sampel dengan fase diam kecil menyebabkan sampel menjadi cepat terelusi dan waktu retensi cepat. Nilai lempeng teoritis dipengaruhi oleh pemilihan pada kolom. Kolom yang memberikan jumlah lempeng teoritis yang besar dan nilai HETP yang 4
kecil akan mampu memisahkan komponen-komponen dalam suatu campuran yang lebih baik yang berarti bahwa efisiensi kolom semakin besar. Nilai faktor simetri merupakan faktor yang membuat suatu bentuk puncak menjadi asimetris. Faktor simetri disebabkan dari mekanisme reaksi hidrofobik tergantung pada kemurnian partikel silika yang ada dalam kolom KCKT pada saat pemisahan yang berinteraksi dengan senyawa analisa yang membuat puncak menjadi asimetris. Pengembangan metode dan penelitian membutuhkan kolom yang bagus dan murni untuk mendapatkan hasil puncak yang sempurna dan untuk menghindari terjadinya tailing peak. Uji Validasi Linearitas Linearitas bertujuan untuk menunjukkan ada atau tidaknya hubungan yang linear antara konsentrasi zat aktif dengan respon metode yang digunakan. Linearitas cenderung korelasi antara dua variable biasanya dinyatakan dalam koefisien korelasi (r). Kurva yang didapat berupa garis lurus (linear) karena r yang didapat memenuhi persyaratan untuk garis linear (r 0,9980). Hasil uji linieritas dari campuran Dextromethorphan HBr dan Diphenhydramin HCl dengan konsentrasi 25 %, 50 % 100 %, 150 % dan 200 %. Konsentrasi Diphenhydramine HCl yaitu 54 ppm, 108 ppm, 216 ppm, 324 ppm, 432 ppm dan konsentrasi Dextromethorphan HBr yaitu 40 ppm, 80 ppm, 160 ppm, 240 ppm, 320 ppm. Ada beberapa pertimbangan yang diperhatikan dalam pemilihan data persamaan kurva baku yang didasarkan pada nilai r terhitung, nilai A (intersept), nilai B (slope), dan SE (standard error). Dalam penelitian ini, parameter utama dipilih adalah berdasarkan nilai r terhitung. Berdasarkan hasil uji linearitas untuk Dextromethorphan HBr y = 19881x - 30425, dengan nilai r = 0,9999. Hal ini menunjukkan respon analit terhadap alat linier atau cukup tinggi. Maka dapat dinyatakan bahwa hasil uji linieritas memenuhi syarat yaitu nilai koefisien korelasi (r) 0,9980. Hal ini membuktikan bahwa adanya korelasi yang baik antara konsentrasi zat dengan respon metode yang dipakai. Kurva Linearitas Dextromethorphane HBr Berdasarkan hasil uji linearitas untuk Diphenhydramin HCl y = 35020x - 88541, dengan nilai r = 0,9999. Hal ini menunjukkan respon analit terhadap alat linier atau cukup tinggi. Maka dapat dinyatakan bahwa hasil uji linieritas memenuhi syarat yaitu nilai koefisien korelasi (r) 0,9980. Hal ini membuktikan bahwa adanya korelasi yang baik antara konsentrasi zat dengan respon metode yang dipakai. Kurva Linearitas Diphenhydramine HCl 5
Akurasi Akurasi dilakukan pada tiga titik konsentrasi yaitu 50 %, 100%, dan 150 % yang dilakukan sebanyak 3 kali pengerjaan. Pelaporan hasil dalam bentuk persen perolehan kembali (recovery) yang bertujuan untuk melihat variasi nilai persentase perolehan kembali parameter akurasi yang didapat dengan nilai sebenarnya. Berdasarkan menunjukkan nilai % recovery Dextromethorphan HBr sebesar 100,665 dan Diphenhydramine HCl 100,902. Kedua hasil akurasi ini memenuhi persyaratan uji akurasi yaitu 98,0-102,0 %. Metode ini akurat karena memberikan hasil konsentrasi terukur hampir sesuai dengan nilai yang sebenarnya. Presisi Uji presisi yang dilakukan merupakan Repeatability System (Keterulangan Sistem) dengan melakukan pengukuran terhadap luas area dan waktu retensi secara berulang sebanyak 6 kali pengulangan pada kondisi yang sama untuk masing-masing larutan sampel yang homogen dan kondisi yang sama. Nilai presisi yang dinyatakan dengan parameter standar deviasi relative (% RSD) dimana kriteria seksama diperoleh jika Area Dextromethorphan HBr Area Diphenhydramine HCl % Kadar Dextromethorphan HBr % Kadar Diphenhydramine HCl 1 3188507 7563923 100,352 100,571 2 3180183 7582758 100,100 100,822 3 3215713 7615631 101,219 101,259 4 3166118 7523355 99,658 101,026 5 3134452 7550236 98,661 100,032 6 3113470 7550236 98,000 100,389 Mean 3166407 7572334 99,667 100,683 SDV 37237 33483 1,172 0,445 %RSD 1,2 0,4 1,2 0,4 metode memberikan simpangan baku relatif 2 %. Pada tabel didapat % RSD Dextromethorphan HBr sebesar 1,2 % dan Diphenhydramine HCl sebesar 0,4 % hal ini menunjukkan hasil saat dilakukan pengulangan analisis metode tersebut memenuhi syarat. IV KESIMPULAN Hasil optimasi fase gerak pada analisis campuran Dextromethorphan HBr dan Diphenhydramin HCl dalam sirup obat batuk dengan metode HPLC dengan menggunakan kolom Waters Sunfire C 8 (4,6 mm x 250 mm, 5µm) yaitu dalam komposisi fase gerak Acetonitril : TFA 0,1% dengan perbandingan (30:70) dan laju alir 1,4 ml/menit dengan resolusi sebesar 3,157 dengan persyaratan 2,5. Hasil validasi didapat hasil pengujian linearitas didapatkan hasil koefisien korelasi (r) Dextromethorphan HBr sebesar 0,9999, dan Diphenhydramine HCl sebesar 0,9999. Hasil validasi didapat hasil pengujian akurasi menunjukkan rata-rata % recovery Dextromethorphan HBr sebesar 100,665 % dan Diphenhydramine HCl sebesar 100,902 %, Hasil validasi didapat hasil pengujian kadar Dextromethorphan HBr dan Diphenhydramine HCl didapat hasil kadar Dextromethorphan HBr sebesar 99,667 % dan Diphenhydramine HCl sebesar 100,683 % pada pengujian presisi dan diperoleh hasil RSD Dextromethorphane HBr sebesar 1,2 % dan Diphenhydramine HCl sebesar 0,4 %. V. Daftar Pustaka BPOM. 2003. Petunjuk Oprasional Cara Pembuatan Obat yang Baik (CPOB). Badan Pengawasan Obat dan Makanan. Jakarta. 6
Danusantoso, H. 2001. Analisis Obat Batuk. Universitas Trisakti. Jakarta. David, G. Watson. 2004. Kimia Farmasi Analisis. Buku Ajar untuk mahasiswa farmasi dan praktisi kimia farmasi. Universiti press. Surabaya. Depkes RI. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi IV. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta. Dong,M.W. 2006. Modern HPLC for and or practicing scientists. John Wiley and Sons. New York. Gritter, R.J, 2006. Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB. Bandung. Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya. Majalah ilmu kefarmasian. Vol I, No 3. halaman 117-135. Departemen Farmasi FMIPA UI. Depok. Kartasubrata, Julia. 2001. Dasar Dasar Kromatografi. Pusat Penelitian Kimia Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Bandung. Kazakevich,Y. and LoBrutto,R. 2007. HPLC for pharmaceutical scientints. John Wiley and Sons. Inc 3-4,15. New York. Kibbe, orthur H. 2000. Hand book of pharmaceutical excipient. Edisi III. Pharmaceutical Press. USA. Putro, S. 2006. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Fakultas Farmasi Universitas Sumatra Utara. Medan Muhamad Faisal Fuad. 2012. Pengembangan metode analisis Dextromethorphan HBr dan Diphenhydramine HCl dalam sediaan obat batuk cair secara Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) Pengujian dextrometorphan HBr dan Diphenhydramin. Universitas Sanata Dharma. Yogyakarta. Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka pelajar. Universitas Sumatra Utara. Medan Tjay, Tan Hoan dan Kirana Rahardja. 2007. Obat-obat Penting Khasiat, Penggunaan dan efek-efek samping. Edisi Keenam. PT Elex Media Komputindo. Jakarta. United States Pharmacopiea. 2012. USP. Volume 3-B. USA. Wibisono, Y. 2005. Metode stastistik. Gajah mada university press. Jogjakarta. 7