BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian, Medan dengan ketinggian tempat + 25 meter di atas permukaan laut pada bulan juli 2016 sampai dengan selesai. Bahan dan Alat Adapun bahan yang digunakan adalah isolat murni F. oxysporum, isolat murni bakteri kitinolitik, alkohol 96%, kloroks 5%, kapas, spirtus, cling wrap, aquades, Media Kitin, Media nutrient agar (Na), Media nutrient broth (NB), Media Potato Dextrose Agar (PDA), kertas stensil, aluminium foil, methyl blue, label nama dan bahan yang mendukung lainnya. Adapun alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroskop compound, micropipet, batang kaca, cawan petri, pinset, tabung reaksi, inkubator, timbangan analitik, erlenmeyer, oven, beaker glass, objek glass, autoclave, bunsen, laminar air flow, coke borer, kulkas, jarum ose, gunting, pisau, handsprayer, kamera, alat tulis dan alat yang mendukung lainnya. Metode Penelitian Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL)non Faktorial dengan perlakuan sebagai berikut: BK 0 BK 1 BK 2 = F. oxysporum (Kontrol) = Isolat Bakteri Kitinolitik Tongging A + F. oxysporum = Isolat Bakteri Kitinolitik Tongging B + F. oxysporum BK 3 = Isolat Bakteri Kitinolitik Bakara A + F. oxysporum BK 4 = Isolat Bakteri Kitinolitik Bakara B + F. oxysporum 11
BK 5 BK 6 = Isolat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A + F. oxysporum = Isolat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B + F. oxysporum BK 7 = Isolat Bakteri Kitinolitik Samosir A + F. oxysporum BK 8 = Isolat Bakteri Kitinolitik Samosir B + F. oxysporum BK 9 = Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 10% + F. oxysporum BK 10 BK 11 BK 12 BK 13 = Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 20% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 30% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 40% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging A 50% + F. oxysporum BK 14 = Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B 10% + F. oxysporum BK 15 BK 16 BK 17 BK 18 BK 19 BK 20 BK 21 BK 22 BK 23 BK 24 BK 25 BK 26 BK 27 BK 28 = Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B20%+ F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B 30% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B40%+ F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Tongging B50%+ F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 10% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 20% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 30% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 40% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara A 50% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 10%+ F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 20%+ F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 30%+ F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 40% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Bakara B 50% + F. oxysporum 12
BK 29 BK 30 BK 31 BK 32 BK 33 BK 34 BK 35 BK 36 BK 37 BK 38 = Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A10% + F. oxysporum = FiltratBakteri Kitinolitik Haranggaol A20% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A 30% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A 40% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol A50% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B10% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B 20% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B30% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B40% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Haranggaol B50% + F. oxysporum BK 39 = Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 10% + F. oxysporum BK 40 = Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 20% + F. oxysporum BK 41 = Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 30% + F. oxysporum BK 42 = Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 40% + F. oxysporum BK 43 = Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir A 50% + F. oxysporum BK 44 = Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir B 10% + F. oxysporum BK 45 =FiltratBakteri Kitinolitik Samosir B 20% + F. oxysporum BK 46 = Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir B 30%+ F. oxysporum BK 47 BK 48 = Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir B 40% + F. oxysporum = Filtrat Bakteri Kitinolitik Samosir B 50% + F. oxysporum 13
Jumlah ulangan sebanyak 3, yang diperoleh dari: t(r-1) 15 49 (r-1) 15 49r - 49 15 49r 64 r 1,3 r 2 Pelaksaan Penelitian Isolasi Bakteri Kitinolitik Eksplorasi bakteri dimulai dengan mencari tanah Tanaman sehat ini dapat dianggap telah mendapat stimulus dari mikroorganisme dilingkungan akar yang melindungi akar tanaman dari infeksi patogen. Tanah-tanah dengan fenomena suppressivitas ini diambil dari perakaran rumpun tanaman bawang merah secukupnya untuk isolasi mikroorganisme bakalan di laboratorium Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian USU. Untuk isolasi bakteri, di ambil 10 g sampel tanah rizosfer dicampur dengan 100 ml aquades. Kemudian suspensi tanah dikocok selama 30 menit. Setelah homogen dilakukan pengenceran (10-4 ) dalam aquades. Kemudian 0,2 ml suspensi dari pengenceran disebar dengan batang kaca steril ke medium koloid kitin agar (CCA) dalam cawan petri berdiameter 9 cm. kemudian di inkubasikan selama 2-3 hari. Isolat yang membentuk zona terang dipindahkan ke media pemurnian. Isolasi F. oxysporum Isolasi patogen dilakukan dengan tehnik umpan yaitu dengan mensterilkan terlebih dahulu umbi bawang dengan merendam dalam larutan 1% NaOCl selama 14
20 menit, kemudian umbi bawang secara aseptik disayat dengan ketebalan 3-4 mm menggunakan pisau steril, sayatan umbi bawang ini diletakkan dalam cawan petri steril yang telah dialas dengan kertas saring steril yang dilembabkan dengan air suling steril. Bagian tanaman terinfeksi yang telah mendapat perlakuan sterilisasi permukaan dengan larutan 1% NaOCl selama 3 menit dan dicuci dengan air suling steril sebanyak 3 kali, diletakkan di atas kaca slaid mikroskop. Perlakuan ini diinkubasi tanpa cahaya selama lebih kurang 5 hari pada temperatur 25 26ºC dalam media PDA. Uji Aktifitas Antibiosis Bakteri Kitinolitik di Laboratorium a. Uji aktififitas antibiosis Bakteri kitinolitik Isolat bakteri terjaring diuji secara in-vitro kemampuannya menghambat pertumbuhan F. oxysporum dengan metode pengujian dual kultur. Miselium kultur F. oxysporum dalam medium PDA di diambil dengan bor gabus diamater 5 mm dari bagian tepi pertumbuhan koloni, diinokulasikan pada medium PDA di posisi tengah cawan petri diamater 9 cm, bakteri antagonis diinokulasikan pada petri yang sama di posisi 1 cm dari tepi cawan petri. Bakteri diinokulasikan dalam bentuk suspensi bakteri dari kultur murni bakteri umur 1 hari dari media kaldu nutrien (NB). Sebagai kontrol F. oxysporum di inokulasikan pada medium PDA di tengah cawan petri tanpa jamur antagonis. Zona hambatan yang terbentuk dianggap sebagai aktifitas antibiosis. Aktifitas antibiosis diukur dari persentase nisbah diameter koloni F. oxysporum perlakuan antagonis dengan diameter pertumbuhan koloni kontrol dikali 100%. 15
b. Antibiosis filtrat kultur bebas sel Filtrat kultur bakteri kitinolitik di panen dari kultur masing-masing setelah 5 hari dalam biakan media cair kaldu nutrien. Filtrat di panen dan dan disentrifugasi pada 8.000 rpm pada suhu 4 C selama 10 menit, untuk mendapatkan bebas sel, filtrat kultur disaring menggunakan membran 0,45 Millipore filter. Antibiosis filtrat diuji dalam medium PDA menggunakan cawan petri 9 cm dengan cara mencampurkan filtrat kedalam medium PDA dengan perlakuan 10%, 20%, 30%, 40%, 50%. Cakram miselium F. oxysporum diambil dari tepi koloni kultur aktif dan diinokulasikan tepat di tengah cawan petri. Perlakuan ini diinkubasi selama 5 hari. Peubah Amatan 1. Daerah Hambatan (%) Gambar 1. Metode pengukuran zona hambat bakteri kitinolitik terhadap koloni jamur; A. Koloni jamur, B. Zona hambat bakteri kitinolitik terhadap koloni jamur, C. Titik tengah jamur diletakkan, D. Koloni bakteri kitinolitik, X. Diameter koloni jamur yang terhambat pertumbuhannya, Y. Diameter koloni jamur normal (Suryanto, 2010) Pengukuran pertumbuhan Fusarium oxysporum dilakukan dengan cara mengukur batas akhir pertumbuhan dari fungi patogen pada sumbu X dan batas akhir pertumbuhan fungi patogen pada sumbu Y (Gambar 1), dilakukan setelah terjadi penghambatan bakteri kitinase terhadap fungi patogen dengan rumus uji antagonis YY XX = hhhhhhhhhh 22 16
(Suryanto et al., 2011). 2. Pengamatan Struktur Hifa Abnormal Pengamatan struktur hifa secara mikroskopis dilakukan dengan cara mengamati ujung miselium pada daerah zona hambat fungi patogen. Abnormalitas pada pertumbuhan miselium fungi pathogen seperti, pembengkokan ujung miselium, miselium pecah, miselium berbelah, miselium bercabang, miselium lisis, dan miselium tumbuh kerdil yang diamati dibawah mikroskop dan dilakukan dokumentasi (Lorito et al., 1992). 3. Kecepatan Tumbuh Laju pertumbuhan cendawan diketahui dengan cara mengukur pertambahan diameter koloni cendawan setiap hari setelah inokulasi (hsi) sampai hari ke-5 (hsi). Analisis Data Data berupa hasil pengamatan morfologi serta pertumbuhan hifa abnormal dipaparkan secara deskriptif, sedangkan hasil berupa datakuantitatif daerah hambatan dilakukan perhitungan statistik analisa varian dengan Uji Duncan dengan taraf 5 % 17