BAB I PENDAHULUAN Latar belakang Seiring dengan peningkatan tuntutan atas jaminan kualitas, keamanan, dan khasiat obat bahan alam, produksi industri obat tradisional telah bergeser dari bentuk sediaan jamu serbuk simplisia menjadi bentuk sediaan modern, yaitu penggunaan ekstrak sebagai bahan baku produksi. Untuk memenuhi target tersebut, diperlukan metode dan proses ekstraksi yang efektif dan efisien agar didapatkan ekstrak dengan kadar zat aktif maksimal dan zat penyerta seminimal mungkin. Teknik ekstraksi bertingkat untuk menghasilkan fraksi dan pembuatan ekstrak terpurifikasi merupakan upaya untuk mendapatkan ekstrak dengan kadar zat-zat ballast yang rendah sehingga akan meningkatkan aktivitas senyawa yang diinginkan (List dan Schmidt, 1989). Proses ekstraksi dapat dianalogikan dengan proses transfer massa, terutama ekstraksi padat-cair dengan difusi sebagai mekanisme transpor (Treybal, 1980). Efisiensi ekstraksi diketahui merupakan fungsi dari kondisi proses. Beberapa faktor yang mempengaruhi konsentrasi senyawa yang diinginkan dalam ekstrak antara lain adalah: jenis pelarut, suhu, kecepatan aliran pelarut, dan ukuran partikel. Waktu kontak dan rasio padat-cair juga dilaporkan menjadi variabel yang signifikan. Peran positif atau negatif masing-masing faktor tersebut dalam proses transfer massa tidak selalu jelas (Pinelo dkk., 2005). Penelitian di bidang optimasi ekstraksi telah banyak dilakukan diantaranya dengan metode surface response, studi eksperimental, perhitungan kinetika reaksi, dan extraction modelling dengan 1
tujuan untuk mendapatkan proses ekstraksi yang efisien dan efektif (Athimulam dkk., 2006; XuJie dan Wei, 2008). Purifikasi ekstrak adalah suatu proses untuk menghilangkan zat-zat yang tidak mendukung aktivitas, sehingga ekstrak yang didapat adalah ekstrak yang kaya dengan zat bioaktif (List dan Schmidt, 1989). Klorofil adalah zat yang banyak terkandung pada daun dan tidak memiliki aktivitas imunostimulan. Salah satu cara yang dapat digunakan untuk purifikasi ekstrak dari klorofil adalah elektrokoagulasi (Chairungsi dkk., 2006 a, Jumpatong dkk., 2006). Proses deklorofilisasi menggunakan teknik elektrokoagulasi lebih efektif dibandingkan teknik konvensional menggunakan pelarut organik (Chairungsi dkk., 2006 a ). Eliminasi zat ballast seperti klorofil akan menghasilkan ekstrak bahan tumbuhan dengan kandungan zat aktif lebih tinggi. Beberapa jenis tanaman telah terbukti mempunyai aktivitas sebagai imunostimulan, salah satunya adalah sambiloto (Andrograpis paniculata Nees.). Ekstrak etanolik sambiloto dan andrografolid hasil isolasinya, mampu menaikkan respon imun spesifik dan nonspesifik pada tikus. Mekanisme ekstrak etanolik sambiloto sebagai imunostimulan adalah dengan meningkatkan respon terhadap antigen dengan cara meningkatkan jumlah antibodi, meningkatkan jumlah dan proliferasi sel limfosit, dan meningkatkan indeks migrasi makrofag (Puri dkk., 1993). Ekstrak metanolik, fraksi diklormetan ekstrak metanolik, dan senyawasenyawa diterpen yang diisolasi dari fraksi diklormetan ekstrak sambiloto dilaporkan mempunyai aktivitas sebagai imunostimulan. Senyawa-senyawa diterpen tersebut adalah andrografolid, 14-deoksiandrografolid, dan 14-deoksi-11,12-didehidroandrografolid (Kumar dkk., 2004). Senyawa neoandrografolid yang diisolasi dari sambiloto dilaporkan mampu menghambat produksi oksida nitrit (NO) pada makrofag (Batkhuu dkk., 2002). Namun demikian, dilaporkan pula bahwa dalam bentuk senyawa murni, aktivitas farmakologiknya lebih rendah dibandingkan dalam bentuk ekstrak (Puri dkk., 1993). Hal ini menunjukkan 2
bahwa ada golongan senyawa lain yang memiliki efek imunostimulan di luar andrografolid dan turunannya. Penelitian mengenai optimasi ekstraksi andrografolid dari sambiloto dengan metode ekstraksi sinambung menggunakan alat soxhlet, ultra sonic dan microwave telah dilaporkan oleh beberapa peneliti (Hartati dkk., (2015); Kumoro dan Hasan (2006); Rao dan Rathod (2015 a ), dan Wongkittipong dkk., (2004)). Aplikasi berbagai metode tersebut untuk memperoleh ekstrak dengan kadar zat aktif tinggi sulit diterapkan di industri obat tradisional karena pada umumnya industri tersebut masih menggunakan metode maserasi, perkolasi atau modifikasi keduanya, serta belum sampai taraf eliminasi zat ballast. Klorofil merupakan zat ballast yang banyak terdapat pada bagian daun. Salah satu penelitian terkait hal itu adalah upaya deklorofilisasi ekstrak etanolik sambiloto yang dilaporkan oleh Jumpatong dkk. (2006), namun penelitian tersebut tidak dilakukan terhadap ekstrak hasil optimasi. Herba patikan kebo atau Euphorbia hirta L. (familia Euphorbiaceae) secara empirik banyak digunakan sebagai analgetika, penanganan pada disentri amuba, anti diare, tukak lambung, dan asma (Basma dkk., 2011; Patil dkk., 2009). Ekstrak daun tanaman ini dilaporkan memiliki aktivitas imunomodulator (Patil dkk., 2009; Ramesh dan Padmavathi, 2010). Menurut hasil uji bioautografi, senyawa fenolik dalam daun, batang, bunga, dan akar patikan kebo memiliki potensi sebagai penangkap radikal bebas dan pereduksi Fe (III) yang menunjukkan kemampuan tanaman ini sebagai antioksidan (Basma dkk., 2011). Senyawa flavonoid digunakan sebagai penanda aktvitas antidiare herba patikan kebo (Mallavadhani dkk., 2002). Ekstrak etanolik patikan kebo mampu menghambat fungsi inducible Nitric Oxide Synthase (inos) protein dan induksi NO sehingga berpotensi sebagai agen anti-inflamasi (Shih dkk., 2010). Pengujian aktivitas ekstrak ini pada unggas menghasilkan kesimpulan bahwa pada dosis rendah ekstrak berperan sebagai imunostimulan (Zafar dkk., 2006). 3
Mekanisme dasar efek imunostimulan oleh senyawa alami diduga terjadi melalui stimulasi makrofag dan modulasi sistem komplemen (Schepetkin dan Quinn, 2006). Makrofag merupakan bentuk pertahanan sistem imun pertama kali menghadapi patogen yang menyerang melalui fungsi fagositosis, mikrobisidal, dan tumorisidal, yang dilanjutkan dengan dilepaskannya beberapa jenis mediator. Salah satu jenis mediator yang dilepaskan tersebut adalah reactive oxygen species (ROS). Peningkatan kadar ROS akan berakibat pada perubahan keseimbangan antara oksidasi dan sistem antioksidan tubuh, yang menyebabkan produksi lipid peroksidasi (LPO) karena terjadinya kerusakan protein dan deoxy nucleid acid (DNA) akibat oksidasi (Pamok dkk., 2009; Victor dkk., 2004 a ). Keseimbangan produksi prooksidan dan pertahanan antioksidan adalah penting untuk fungsi sel. Gangguan dalam keseimbangan ini menyebabkan timbulnya stres oksidatif. Untuk mengatasi peningkatan kadar ROS berlebih maka diperlukan senyawa antioksidan yang dapat mengurangi stress oksidatif sehingga terjadi peningkatan imunitas (Knight, 2000; Pamok dkk., 2009; Yuan dkk., 2009). Dalam hal ini terdapat kaitan antara aktivitas imunostimulan dan antioksidan. Usaha peningkatan aktivitas farmakologis obat yang berasal dari bahan alam dengan kombinasi 2 atau lebih jenis ekstrak telah banyak dilakukan. Scholey dan Kennedy (2002) menyatakan bahwa pada beberapa kombinasi ekstrak terjadi efek sinergis dengan hasil yang lebih efektif dibandingkan ekstrak tunggalnya. Hal tersebut dijelaskan oleh Wagner (2006), bahwa efek sinergis ditimbulkan oleh adanya interaksi antar komponen aktif baik dalam ekstrak tunggal maupun kombinasi. Kombinasi dua obat, A dan B yang jelas memiliki efek sejenis dapat menghasilkan interaksi sinergis atau antagonis yang dapat di gambarkan dengan nilai indeks interaksi. Pengukuran parameter indeks interaksi berdasar pada relasi isobol, yaitu dosis yang memberikan efek yang sama (Isobol = iso-efek), sedangkan metode isobol (isobolar method) adalah metode pengukuran interaksi 2 senyawa obat berdasarkan relasi hubungan dosis dan 4
respon yang ditimbulkan masing-masing obat tunggal dan kombinasinya pada dosis-dosis yang ditentukan (Tallarida, 2002). Pada penelitian ini, dilakukan studi tentang pengaruh faktor ukuran partikel simplisia, komposisi etanol-air, waktu maserasi, suhu, kecepatan pengadukan, dan rasio simplisia/pelarut terhadap ekstraksi andrografolid dari herba sambiloto dan ekstraksi flavonoid dari herba patikan kebo. Pada penelitian ini juga akan dilihat interaksi kombinasi ekstrak etanolik sambiloto dan patikan kebo, terhadap aktivitas fagositosis makrofag yang menggambarkan kombinasi antara aktivitas imunostimulan dan antioksidan. Kombinasi antara senyawa yang memiliki aktivitas imunostimulan dan antioksidan diharapkan akan menghasilkan interaksi sinergis terhadap fagositosis makrofag. Perumusan Masalah Berdasarkan latar belakang di atas, permasalahan yang timbul adalah: a. Bagaimanakah kondisi ekstraksi yang dapat melarutkan secara optimal andrografolid dari sambiloto dan senyawa flavonoid dari patikan kebo? b. Bagaimanakah kondisi optimal deklorofilisasi ekstrak sambiloto dan patikan kebo dengan metode elektrokoagulasi untuk mengurangi kandungan klorofil a dalam ekstrak? c. Apakah kombinasi ekstrak etanolik sambiloto yang mengandung andrografolid dan patikan kebo yang mengandung flavonoid memiliki aktivitas fagositosis makrofag mencit secara in vitro lebih baik dibandingkan ekstrak tunggalnya? d. Bagaimanakah interaksi antara ekstrak etanolik sambiloto dan patikan kebo terhadap respon aktivitas fagositosis makrofag in vitro? e. Fraksi ekstrak sambiloto dan patikan kebo manakah yang memiliki aktivitas fagositosis makrofag in vitro? 5
Keaslian Penelitian Kumoro dan Hasan (2006) melaporkan bahwa ekstraksi andrografolid dengan alat Soxhlet dapat dimodelkan dengan persamaan matematika berdasarkan fenomena transfer massa. Wongkittipong dkk. (2004), juga melaporkan bahwa ekstraksi andrografolid dari simplisia penghasilnya merupakan suatu proses ekstraksi padat cair sehingga dapat dimodelkan dan dibandingkan dengan hasil eksperimen serta dapat pula ditentukan kinetika reaksinya. Namun karena kedua penelitian tersebut menggunakan metode ekstraksi sinambung dengan alat Soxhlet yang pada umumnya dilakukan pada skala laboratorium, maka penerapan di industri tidak mudah karena peralatan untuk scalling up yang relatif rumit. Optimasi ekstraksi patikan kebo menggunakan metode refluks dilaporkan oleh Xiong dkk. (2010), sedangkan optimasi ekstraksi menggunakan metode maserasi belum pernah dilaporkan. Elektrokoagulasi dilaporkan mampu mengendapkan klorofil, karotenoid, tanin, dan senyawa kuinon (Chairungsi dkk., 2006 a ). Robić dan Miranda (2011) menyebutkan bahwa elektrokoagulasi efektif untuk mengurangi kandungan klorofil dari ekstrak daun tembakau dan tidak berpengaruh terhadap kandungan proteinnya. Jumpatong dkk. (2006) telah melaporkan usaha deklorofilisasi dengan elektrokoagulasi terhadap ekstrak etanolik Solanum laciniatum, Andrographis paniculata, Stevia rebaudiana, Centella asiatica, dan Cassia siamea. Pada ekstrak Andrographis paniculata hasil deklorofilisasi, didapatkan kadar andrografolid yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak awal. Ekstraksi dilakukan dengan etanol 70 %. Pengurangan kadar klorofil a dalam ekstrak etanol daun mangga dengan elektrokoagulasi dilaporkan menurunkan kandungan senyawa fenolik (Nurfitri dan Puspitasari, 2011). Pengaruh elektrokoagulasi terhadap senyawa golongan flavonoid belum pernah dilaporkan. 6
Penelitian mengenai kombinasi ekstrak etanolik sambiloto dan patikan kebo dengan aktivitas peningkatan fagositosis makrofag secara in vitro belum pernah dilaporkan. Urgensi (kepentingan) Penelitian Berdasarkan hasil penelitian ini diperoleh suatu metode ekstraksi sambiloto dan patikan kebo paling baik yang mampu menghasilkan ekstrak sambiloto dan patikan kebo dengan masing-masing kadar andrografolid dan flavonoid total tertinggi dengan mempertimbangkan faktor ekonomi sehingga dapat diaplikasikan di industri obat tradisional. Manfaat lain yang diharapkan dari hasil penelitian ini adalah adanya bukti ilmiah kombinasi ekstrak sambiloto dan patikan kebo untuk meningkatkan aktivitas imunostimulan. Tujuan Penelitian 1. Tujuan Umum Untuk mengoptimalkan penggunaan bahan alam dalam meningkatkan kesehatan. Tujuan khusus: a. Menentukan parameter-parameter yang berpengaruh terhadap ekstraksi yaitu ukuran partikel, komposisi pelarut, waktu maserasi, pengadukan, perbandingan simplisia dengan pelarut dan suhu yang mampu menghasilkan ekstrak yang memiliki kandungan andrografolid dalam sambiloto dan senyawa flavonoid dalam patikan kebo tertinggi. b. Menentukan kondisi terbaik deklorofilisasi kedua ekstrak menggunakan metode elektrokoagulasi dengan parameter waktu dan jenis elektrode. c. Menentukan aktivitas fagositosis makrofag in vitro ekstrak sambiloto, ekstrak patikan kebo dan kombinasi keduanya. d. Menentukan jenis interaksi antara ekstrak sambiloto dan patikan kebo terhadap respon aktivitas fagositosis makrofag in vitro. 7
Menentukan fraksi ekstrak etanolik sambiloto dan patikan kebo yang memiliki aktivitas fagositosis 8