15 3 METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari sampai April 2011. Penelitian dilakukan di Laboratorium Karakterisasi Bahan Baku Hasil Perairan (preparasi sampel), Laboratorium Formulasi dan Diversifikasi Hasil Perairan (proses perebusan dan pengukusan); Laboratorium Biokimia Hasil Perairan (uji komposisi kimia), Laboratorium Mikrobiologi Hasil Petairan (homogenisasi), Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Laboratorium Pengujian (analisis profil dan kelarutan mineral remis), Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Laboratorium Terpadu (proses sentrifuse), Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah remis (Corbicula javanica) yang diperoleh dari sungai yang berada di situ Gede, Bogor. Bahan kimia yang digunakan untuk uji proksimat antara lain: akuades; HCl 0,02 N; H 2 SO 4 pekat; NaOH; H 3 BO 3 ; indikator metilen merah; larutan heksana; kertas saring Whatman no. 42; HCl 10% dan AgNO 3 sedangkan untuk analisis kandungan dan kelarutan mineral adalah HNO 3 ; HClO 4 ; akuades; kertas saring Whatman no. 42; asam sitrat pekat dan larutan standar. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merek Perkin Elmer AAnalyst 100, Spectrophotometer, sentrifuse, homogenizer, gelas piala, labu takar, pisau, panci stainless steel, aluminium foil, gelas ukur, oven, timbangan, pipet, cawan dan termometer. 3.3 Tahap Penelitian Penelitian dilaksanakan dalam beberapa tahap yang meliputi pengambilan sampel, identifikasi (berat, panjang, lebar, dan rendemen), pengolahan dan penentuan konsentrasi garam (0,5%, 1%, 1,5% dan 2%) melalui uji organoleptik. Remis selanjutnya dianalisis komposisi kimia (air, abu, protein dan lemak),
16 analisis total mineral yang meliputi mineral makro dan mikro dan analisis kelarutan mineral, serta menentukan perlakuan terbaik. Diagram alir total mineral dan kelarutannya dapat dilihat pada Gambar 2. Sampel Kontrol Perebusan 100 o C, 9 menit Perebusan air garam 100 o C, 9 menit (konsentrasi terpilih) Pengukusan 100 o C, 13 menit 5 gram 10 gram Air Preparasi sampel padat menjadi larutan Homogenisasi 10000 rpm, 2 menit Pengenceran larutan Pengukuran mineral Sentrifuse 7000 rpm 4 o C, 10 menit Filtrasi Kandungan mineral Supernatan Pengukuran Ca, Mg, Ca, P Kelarutan mineral Gambar 2 Diagram alir total mineral dan kelarutannya. Keterangan : = Input/output = Proses = Data
17 3.3.1 Pengambilan sampel dan proses pengolahan Pengambil sampel remis dilakukan di Sungai sekitar Situ gede, Bogor. Remis tersebut kemudian dimasukkan dalam baskom yang berisi air bersih. Sampel remis yang diperoleh, pertama-tama dilakukan identifikasi dengan penentuan berat awal dari 30 ekor, setelah itu sampel dihitung rendemennya dengan rumus: Rendemen (%) = Bobot contoh (g) Bobot total (g) x 100% Daging remis segar dipisahkan dari cangkang dan jeroannya, kemudian dimasukkan ke dalam plastik dan ditutup rapat serta diberi kode yang jelas sebagai daging segar. Perebusan dengan air dan perebusan garam (0,5%, 1%, 1,5% dan 2%) dilakukan pada suhu 100 0 C selama 9 menit, sedangkan pengukusan dengan air dilakukan selama 13 menit pada suhu 100 o C. Penentuan waktu dan suhu yang tepat untuk mendapatkan remis yang matang dilakukan pada penelitian pendahuluan. Remis diambil dagingnya untuk dimasukkan ke dalam plastik dan ditutup rapat serta diberi kode yang jelas sebagai daging yang telah mengalami pengukusan dan perebusan. Penimbangan selalu dilakukan sebelum dan setelah pengolahan untuk mengetahui ada tidaknya penambahan atau penyusutan berat. 3.3.2 Uji organoleptik Uji organoleptik dilakukan oleh 30 orang panelis semi terlatih menggunakan lembar penilaian uji hedonik berdasarkan SNI-01-2346-2006, spesifikasi yang dinilai adalah rasa dengan nilai 1-9. Uji organoleptik parameter rasa dilakukan untuk mengetahui konsentrasi garam (0,5%, 1%, 1,5% dan 2%) yang paling disukai oleh panelis sehingga terpilih sebagai konsentrasi garam yang tepat pada perlakuan perebusan garam. 3.3.3 Analisis komposisi kimia Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk memprediksi komposisi kimia suatu bahan, termasuk di dalamnya analisis kadar air, protein, abu dan lemak.
18 1) Analisis kadar air (AOAC 1995) Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 0 C selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 15 menit) dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Cawan tersebut ditimbang kembali hingga beratnya konstan. Sebanyak 5 gram contoh dimasukkan ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105 0 C selama 5 jam, kemudian cawan dimasukkan ke dalam desikator sampai dingin dan selanjutnya ditimbang kembali. Perhitungan kadar air % Kadar air = Keterangan: B = berat sampel (gram) B1= berat (sampel+cawan) sebelum dikeringkan B2= berat (sampel+cawan) setelah dikeringkan 2) Analisis kadar abu (AOAC 1995) (B1 B2) x 100% B Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 600 0 C, kemudian didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api hingga tidak berasap lagi. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 0 C selama 1 jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Kadar abu ditentukan dengan rumus: Berat abu (g) = berat sampel dan cawan akhir (g) berat cawan kosong (g) Kadar abu (berat basah) = Berat abu (g) X 100 % Berat sampel awal 3) Analisis kadar lemak (AOAC 1995) Contoh seberat 5 gram dimasukkan ke dalam kertas saring pada kedua ujung bungkus ditutup dengan kapas bebas lemak dan selanjutnya sampel yang telah dibungkus dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya dan disambungkan dengan tabung Soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung Soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak (n-heksana), kemudian dilakukan refluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang
19 ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 0 C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan. Perhitungan kadar lemak: % Kadar lemak = W3 - W2 X 100 % W1 Keterangan : W1 = Berat sampel (gram) W2 = Berat labu lemak kosong (gram) W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram) 4) Analisis kadar protein (AOAC 1995) Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. metode mikro Kjeldahl. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan Sampel ditimbang sebanyak 0,25 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml, lalu ditambahkan satu butir kjeltab dan 3 ml H 2 SO 4 pekat. Contoh didestruksi pada suhu 410 0 C selama kurang lebih 1 jam sampai larutan jernih lalu didinginkan. Setelah dingin, ke dalam labu kjeldahl ditambahkan 50 ml akuades dan 20 ml NaOH 40 %, kemudian dilakukan proses destilasi dengan suhu destilator 100 0 C. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi campuran 10 ml asam borat (H 3 BO 3 ) 2 % dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda. Setelah volume destilat mencapai 40 ml dan berwarna hijau kebiruan, maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh. Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut : % N = (ml HCl ml Blanko) x N HCl x 14 x Fp X 100 % mg contoh % Kadar protein = % N x faktor konversi (6,25) Keterangan : Fp= Faktor pengenceran
20 3.3.4 Pengujian total mineral 1) Pengujian total mineral Ca, Na, K, Mg, Fe, Zn, Se dan Cu (APHA 2005) Prinsip pengujian total mineral yaitu mengetahui nilai absorpsi logam dengan menggunakan metode Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS). Sebanyak 2 gram sampel daging remis yang sudah dicacah dimasukkan ke dalam erlenmeyer 150 ml kemudian ditambahkan 5 ml asam nitrat 65% yang bertujuan untuk melarutkan kandungan anorganik dan panaskan di atas hot plate lalu dinginkan. Setelah dingin tambahkan ke dalam Erlenmeyer asam peklorat 2 ml, hal ini bertujuan untuk menguapkan kandungan organik pada sampel lalu panaskan di atas hot plate dan dinginkan. Larutan diencerkan dengan aquades menjadi 100 ml dalam labu takar lalu larutan disaring dengan kertas saring Whatman sampai didapatkan larutan yang jernih. Sejumlah larutan stok standar dari masing-masing mineral diencerkan dengan menggunakan akuades sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang diinginkan. Larutan standar, blanko dan contoh dialirkan ke dalam Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merk Perkin Elmer AAnalyst 100 dengan panjang gelombang dari masing-masing jenis mineral, kemudian diukur absorbansi atau tinggi puncak standar, blanko dan contoh pada panjang gelombang dan parameter yang sesuai untuk masing-masing mineral. Perhitungan kadar mineral (mg/kg) basis basah Kadar mineral= Keterangan: ppm terbaca x fp bobot sampel fp = faktor pengencer 3) Pengujian fosfor (APHA 2005) Prinsip pengujian fosfor yaitu mengetahui nilai absorpsi logam fosfor dengan menggunakan metode spektrofotometri. Sebanyak 2 gram sampel daging remis yang sudah dicacah dimasukkan ke dalam erlenmeyer 150 ml kemudian ditambahkan 140 ml asam sitrat yang bertujuan melarutkan kandungan fosfor pada sampel, panaskan di atas hot plate lalu dinginkan. Setelah dingin tambahkan ke dalam Erlenmeyer asam peklorat 2 ml, hal ini bertujuan untuk menguapkan
21 kandungan organik pada sampel lalu panaskan di atas hot plate dan dinginkan. Sebanyak 25 ml pereaksi vanadat molibdat ditambahkan kedalam sampel tersebut, kemudian di encerkan dengan akuades menjadi 100 ml dalam labu takar lalu larutan disaring dengan kertas saring Whatman sampai didapatkan larutan yang jernih. Sejumlah larutan stok standar dari mineral fosfor diencerkan dengan menggunakan akuades sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang diinginkan. Larutan standar, blanko dan contoh diukur ke alat spektrofotometer dengan panjang gelombang 660 nm. Perhitungan kadar mineral (mg/kg) basis basah Kadar mineral= Keterangan: fp = faktor pengencer ppm terbaca x fp bobot sampel 3.3.5 Analisis kelarutan mineral (Santoso 2003 modifikasi pelarut air) Sampel yang akan di uji yaitu segar,perebusan, perebusan dengan menggunakan garam dan pengukusan dihomogenkan terlebih dahulu lalu diambil 10 gram untuk dianalisis dan ditambahkan 40 ml air lalu homogenizer pada kecepatan 5.000-10.000 rpm selama 2 menit untuk fraksi terlarut. Sampel di sentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm, 4 0 C selama 10 menit. Hasil dari sentrifugasi selanjutnya disaring menggunakan kertas saring Whatman no 42. Supernatan diukur mineral terlarut yaitu kalsium, magnesium, natrium dan fosfor menggunakan Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merek Perkin Elmer Aanalyst 100 dan dihitung sebagai persentase terhadap total mineral yang dianalisis (kalsium, besi, seng dan selenium). Persentase kelarutan kemudian dihitung dengan mengurangi kontrol (tanpa pengolahan) dengan pengolahan dibagi dengan kontrol (tanpa pengolahan).
22 3.3.6 Rancangan percobaan dan analisis data a. uji organoleptik Konsentrasi garam untuk proses perebusan garam ditentukan dengan menggunakan uji organoleptik. Data hasil uji organoleptik dianalisis menggunakan Kruskal Wallis dengan uji Chi Square. Apabila nilai x 2 hitung > x 2 tabel maka tolak Ho (perbedaan konsentrasi garam memberikan pengaruh nyata terhadap parameter rasa remis). menggunakan rumus sebagai berikut (Steel dan Torrie 1993): (1) H = (2) FK = 12 Ri 2 3(n + 1) n(n+1) ni T n 1 n(n+1) Prosedur pengujian Kruskall Wallis (3) H = H FK Keterangan n i = banyaknya pengamatan tiap perlakuan atau jumlah panelis N = banyaknya data R i = jumlah rata-rata tiap perlakuan ke-i T = banyaknya pengamatan yang seri dalam tiap ulangan H = H terkoreksi FK = faktor terkoreksi Apabila hasil uji Chi Square (Lampiran 12) menunjukkan di antara perlakuan tersebut memberikan pengaruh nyata terhadap rasa remis maka pengujian dilanjutkan dengan uji Multiple Comparison dengan rumus sebagai berikut (Steel dan Torrie 1993): R i R; j >< Z a/k(k 1) N(N + 1) 12 1 ni + 1 nj Keterangan : R i = rata-rata rangking perlakuan ke-i R j = rata-rata rangking perlakuan ke-j N = banyaknya data K = banyaknya perlakuan n i = jumlah data perlakuan ke-i = jumlah dat perlakuan ke-j n j
23 b. Komposisi kimia, total mineral dan kelarutan mineral Rancangan percobaan yang digunakan untuk menguji pengaruh metode pengolahan terhadap kandungan mineral dan kelarutan mineral adalah metode rancangan acak lengkap (RAL) dengan satu faktor dan 4 taraf (sampel segar, pengukusan, perebusan tanpa garam dan perebusan dengan garam). Data dianalisis dengan ANOVA (Analysis Of Variant) atau uji F, sebelum dilakukan uji F terlebih dahulu di uji kenormalan data. Uji kenormalan data mengunakan uji Kolmogrov Simirnov. Kurva normal yang dihasilkan pada uji Kolmogrov Simirnov disertakan dengan nilai rata-rata dan standar deviasi (simpangan baku). Nilai rata-rata menggambarkan posisi kurva pada sumbu X, sedangkan standar deviasi menggambarkan sebaran varian. Koefisien keragaman dengan nilai dibawah 50% (median) dinyatakan cukup baik karena dapat membuktikan pada tingkat kepercayaan 95% (Hills dan Little 1998). Suatu data dapat menyebar normal pada: (Walpole 1992). Keterangan: x = rata-rata z = 1,96 µ = (1-α) 100 % σ = simpangan baku n = banyak data x z α/2 σ Koefisien keragaman = σ x x 100 n < μ < x + z α/2 σ n Model rancangannya analisis ANOVA (Analysis Of Variant) atau uji F adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie 1993): Y ij = μ + τi + ε ij Keterangan : Y ij μ τi ε ij = Nilai pengamatan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j (j=1,2) = Nilai tengah atau rataan umum pengamatan = Pengaruh metode pengolahan pada taraf ke-i (i=1,2,3) = Galat atau sisa pengamatan taraf ke-i dengan ulangan ke-j Hipotesa terhadap data hasil uji kandungan mineral pada berbagai metode pengolahan adalah sebagai berikut:
24 H 0 = Metode pengolahan tidak memberikan pengaruh nyata terhadap kandungan mineral. H 1 = Metode pengolahan memberikan pengaruh nyataterhadap kandungan mineral. Hipotesa terhadap data hasil uji kelarutan mineral pada berbagai metode pengolahan adalah sebagai berikut: H 0 = Metode pengolahan tidak memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan mineral. H 1 = Metode pengolahan memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan mineral. Jika uji F pada ANOVA memberikan pengaruh yang berbeda terhadap kandungan mineral atau kelarutan mineral maka dilanjutkan dengan uji Duncan, dengan rumus sebagai berikut: Duncan = tα/2; dbs 2KTS r Keterangan : KTS = Kuadrat tengah sisa dbs = Derajat bebas sisa r = Banyaknya ulangan