14 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dimulai pada bulan Agustus 2011 s/d Agustus 2012 bertempat di Laboratorium Technopark, Labolatorium Mikrobiologi SEAFAST CENTER PAU, dan Laboratorium Kimia Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan baku utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji sorgum varietas Kawali yang diperoleh dari UPT Balai Pengembangan Proses dan Teknologi Kimia LIPI Yogyakarta. Bahan yang dibutuhkan dalam analisis mikrobiologi adalah media Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA), media Potato Dextrose Agar (PDA), dan KH 2 PO 4. Sedangkan bahan yang dibutuhkan dalam analisis fisik adalah minyak goreng dan aquades. Sementara, pada analisis kimia bahan yang dibutuhkan adalah NaCl, asam tanat, reagen Folin-Denis, Na 2 CO 3, heksan, K 2 SO 4, HgO, H 2 SO 2, HCl, NaOH, etanol 85%, asam perklorat, pereaksi DNS, maltosa standar, CH 3 COOH, KI iod, indikator fenolftalein, dan amilosa standar. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat penyosohan model Santake Grain Mill, disc mill, ayakan, oven, timbangan, whiteness meter, spektofotometer, autoclave, vorteks, mikropipet, inkubator, mikroskop, sentrifus, penangas air, Rapid Visco Analyzer (RVA), Scanning Electron Microscope (SEM), mikroscope polarization, dan peralatan gelas untuk analisis. Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahap yaitu (1) penyosohan biji sorgum, (2) pembuatan dan karakterisasi sifat fisik dan kimia tepung sorgum non fermentasi dan tepung sorgum fermentasi, dan (3) pembuatan cookies tepung sorgum. Pada tahap satu dilakukan pengukuran waktu penyosohan dan kadar air optimal biji saat penyosohan. Sementara, yang dilakukan pada tahap dua adalah membuat tepung sorgum non fermentasi dan fermentasi, mengamati mikroba yang terlibat selama fermentasi biji sorgum, dan menganalisis karakteristik fisik dan kimia tepung sorgum non fermentasi dan fermentasi. Sedangkan, yang dilakukan
15 pada tahap ketiga adalah mengaplikasikan tepung sorgum non fermentasi dan fermentasi yang dihasilkan dalam pembuatan produk cookies, serta pengujian organoleptiknya. Tahap 1. Penyosohan Biji Sorgum Penyosohan biji sorgum bertujuan menghilangkan lapisan terluar (kulit), dan kulit ari. Kualitas penyosohan dipengaruhi oleh waktu penyosohan dan kadar air biji sorgum saat penyosohan, sehingga pada tahap ini dilakukan penentuan waktu penyosohan dan kadar air biji optimal yang ditandai dengan rendemen tersosoh dan derajat putih tinggi dan kadar tanin rendah. Diagram alir tahapan penyosohan biji sorgum disajikan pada Gambar 3. Penentuan waktu penyosohan bertujuan untuk mendapatkan waktu penyosohan optimal untuk menghasilkan sorgum sosoh terbaik. Penentuan waktu penyosohan dilakukan dengan cara menyosoh biji sorgum menggunakan Satake Grain Mill selama 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160 dan 180 detik dengan kapasitas 100 g biji sorgum sekali sosoh (Wiratama 2010). Waktu penyosohan terbaik digunakan untuk menentukan kadar air terbaik. Biji Sorgum Sortasi Penyosohan Santake Grain Mill Kapasitas: 100 g Waktu: 20, 40, 60, 80, 100, 120,140 & 180 detik Sorgum Sosoh Sortasi Conditioning Air (%): 0, 5, 10, 15, 20 & 25 Penyosohan Santake Grain Mill Kapasitas: 100 g Waktu: terbaik dari tahap sebelumnya Sorgum Sosoh Gambar 3 Diagram alir penentuan waktu sosoh dan kadar air optimal Penentuan kadar air bertujuan mendapatkan kadar air yang tepat pada saat penyosohan sehingga menghasilkan sorgum sosoh dengan rendemen dan derajat
16 putih tertinggi serta kadar tanin terendah. Penentuan kadar air dilakukan dengan cara melakukan conditioning atau tempering, yaitu menambahkan sejumlah air ke dalam biji sorgum yang bertujuan untuk meningkatkan kadar air biji sorgum. Conditioning dilakukan dengan cara menambahkan air sebanyak 0, 5, 10, 15, 20, dan 25 % (b/v) ke dalam biji sorgum lalu dikemas menggunakan kemasan aluminium foil dan disimpan pada suhu ruang selama 24 jam. Setelah itu, diukur kadar air biji kemudian biji sorgum disosoh dengan kapasitas 100 g menggunakan Satake Grain Mill selama waktu terbaik yang diperoleh dari hasil sebelumnya. Parameter yang diamati adalah rendemen tersosoh, derajat putih, dan kadar tanin. Perlakuan dengan hasil rendemen tersosoh dan derajat putih tertinggi, dengan kadar tanin terendah yang digunakan dalam penelitian selanjutnya. Tahap 2. Pembuatan dan Karakterisasai Tepung Sorgum Non Fermentasi dan Fermentasi Tahapan ini bertujuan untuk membuat tepung sorgum non fermentasi dan fermentasi, mengamati mikroba yang terlibat selama fermentasi biji sorgum, dan menganalisis karakteristik fisik dan kimia tepung sorgum non fermentasi dan fermentasi yang dihasilkan. Diagram alir tahapan pembuatan tepung sorgum non fermentasi dan fermentasi disajikan dalam Gambar 4. Tahapan pembuatan tepung sorgum non fermentasi yaitu biji sorgum yang telah disosoh, direndam dalam air pada suhu ruang selama 1 jam yang bertujuan untuk melunakkan biji sorgum. Setelah itu, biji sorgum dicuci dan dikeringkan hingga kadar air maksimum 15% bk (Codex 1989). Selanjutnya, biji sorgum ditepungkan dan diayak (80 mesh) (Dewi 2000). Tahapan pembuatan tepung sorgum fermentasi meliputi fermentasi biji sorgum, pencucian, pengeringan, penepungan, dan pengayakan. Fermentasi biji sorgum yang dilakukan merupakan modifikasi metode fermentasi (fermentasi asam laktat) dari Hugo et al. (2003) yaitu biji sorgum yang telah disosoh difermentasikan secara alami (spontan) dengan dua perlakuan konsentrasi larutan garam sebagai media fermentasi yaitu konsentrasi larutan garam 1% dan 2%. Fermentasi dilakukan pada suhu ruang (± 28 C) dengan perbandingan larutan garam:sorgum adalah 1:2 (b/v) selama 0, 24, 48, 72, 96, 120 jam. Hasil fermentasi berupa cairan fermentasi selama waktu pengamatan diisolasi BAL dan khamir
17 yang terlibat selama fermentasi spontan sedangkan hasil berupa biji sorgum dicuci, dikeringkan, ditepungkan, dan diayak. Isolasi BAL dan khamir bertujuan untuk mengetahui jumlah BAL dan khamir yang terlibat selama waktu fermentasi. Isolasi ini menggunakan metode Ali dan Mustafa (2009). Pengamatan dilakukan terhadap cairan fermentasi selama 0, 24, 48, 72, 96, 120 jam untuk menghitung jumlah koloni BAL dan khamir. Pemupukan cairan fermentasi pada media MRS (Man Rogosa Sharpe) agar untuk menghitung jumlah koloni BAL dan pada media PDA (Potato Dextrose Agar) untuk menghitung jumlah koloni khamir. Masing-masing perlakuan dilakukan secara duplo. Parameter yang diamati adalah jumlah koloni khamir, jumlah koloni BAL, rendemen tepung, derajat putih tepung, bentuk dan ukuran granula, sifat pasting, daya serap air, daya serap minyak, kadar pati, kadar amilosa, kadar amilopektin dan proksimat (kadar air, karbohidrat, lemak, protein, abu). Sorgum Sosoh Perendaman dalam air Pencucian Pengeringan Penepungan Pengayakan Tepung Sorgum Non Fermentasi spontan Kons garam: 1 & 2% Suhu kamar, 5 hari Biji sorgum Pencucian Pengeringan Penepungan Pengayakan Pemupukan Media MRSA Inkubasi Suhu 37 ºC, 2 hari Koloni BAL Cairan fermentasi Pemupukan Media PDA Inkubasi Suhu ruang, 2 hari Koloni Khamir Tepung Sorgum Gambar 4 Diagram alir tahapan pembuatan tepung sorgum
18 Tahap 3. Pembuatan Cookies Sorgum Tahapan ini bertujuan untuk menghasilkan produk cookies dari tepung sorgum non fermentasi dan fermentasi serta menguji karakteristik organoleptiknya. Pembuatan cookies dilakukan dengan menggunakan tepung komposit, yaitu campuran antara tepung terigu dan tepung sorgum. Persentase jumlah tepung sorgum yang ditambahkan adalah 0, 50, dan 100%. Formulasi pembuatan cookies yaitu tepung komposit (46%), margarin (28%), gula halus (18%), baking soda (0.16%), garam (0.16%), vanili (0.46%). Semua bahan kecuali tepung dicampur dan diaduk menggunakan mixer selama ± 10 menit. Selanjutnya, ke dalam adonan tersebut ditambahkan tepung secara perlahan-lahan sambil diaduk hingga merata. Setelah tercampur adonan tersebut dicetak dan dipanggang dalam oven selama 15 menit pada suhu 150-160 C. Cookies yang dihasilkan didinginkan, dikemas dan siap untuk diuji organoleptiknya. Diagram alir pembuatan cookies dapat dilihat pada Gambar 5. Gula halus, margarin, 1 susu skim, kuning telur, garam dan soda Pencampuran (±10 menit) Pencampuran Tepung sesuai formula Pencetakan Pemanggangan 130-150 ºC selama 20-30 menit Cookies tepung sorgum Gambar 5 Proses pembuatan cookies sorgum Uji organoleptik yang digunakan adalah uji hedonik dan uji skala. Uji hedonik bertujuan untuk mengetahui tingkat kesukaan panelis terhadap produk
19 cookies tepung sorgum. Penilaian tingkat kesukaan didasarkan pada karakteristik produk meliputi warna, aroma, rasa, tekstur, dan keseluruhan. Skor penilaian yang digunakan dalam uji ini ada 7 tingkat, yaitu, skor 1 (sangat tidak suka), 2 (tidak suka), 3 (agak tidak suka), 4 (netral), 5 (agak suka), 6 (suka), dan 7 (sangat suka). Uji skala bertujuan untuk mengetahui tingkat kemasiran dari produk cookies yang dihasilkan menggunakan komposit tepung sorgum. Skor penilaian yang digunakan dalam uji ini ada 7 tingkat, yaitu, skor 1 (sangat masir), 2 (masir), 3 (agak masir), 4 (netral), 5 (agak tidak masir), 6 (tidak masir), dan 7 (sangat tidak masir). Panelis yang digunakan untuk uji organoleptik adalah panelis tidak terlatih sebanyak 25 orang panelis. Analisi Data Data hasil penelitian akan dianalisis dengan ANOVA one-way dan jika hasil uji anova (p< 0.05) menunjukkan perbedaan yang nyata maka dianalisis lebih lanjut dengan uji Duncan s Multiple Range Test (DMRT) (p< 0.05) dengan menggunakan program SAS 9.1.3. Prosedur Analisis Analisis mikrobiologi a. Enumerasi Mikroba (Marcellin et al. (2009) Enumerasi dilakukan dengan cara 10 ml cairan fermentasi yang diperoleh dari masing-masing sampel ditambahkan ke dalam 90 ml larutan pengencer KH 2 PO 4 yang sudah disterilkan kemudian divortex. Serial pengenceran dilakukan sebanyak 10-1 -10-7, kemudian dari masing-masing pengenceran 10-5 -10-7 diambil secara tepat 1 ml dan diinokulasikan pada masing-masing media dengan menggunakan metode tuang sesuai dengan tujuannya masing-masing sebagai berikut: a. Bakteri asam laktat (Saeed et al. 2009) Bakteri asam laktat ditentukan dengan menumbuhkan masing-masing serial pengenceran (10-5 -10-7 ) pada media agar Man Rogosa Sharpe (MRSA) dan diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 48 jam lalu dihitung jumlah koloni yang tumbuh.
20 b. Total khamir (Saeed et al. 2009) Total khamir ditentukan dengan menumbuhkan masing-masing serial pengenceran (10-5 -10-7 ) pada media Potato Dextrose Agar (PDA). Selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam, lalu dihitung jumlah koloni yang tumbuh. b. Perhitungan Total Koloni (BAM 2001) Perhitungan koloni dilakukan dengan menggunakan rumus Standar Plate Count (BAM 2011) dalam satuan cfu/ml: N = ΣC / [((1*n 1 ) + (0.1*n 2 )) * (d)] Keterangan: N = Jumlah koloni per ml atau per gram produk C = Jumlah semua koloni pada semua cawan yang dihitung n 1 n d 2 = Jumlah cawan pada pengenceran pertama = Jumlah cawan pada pengenceran kedua = Pengenceran pertama yang dihitung Limit deteksi metode plating berkisar 25 hingga 250 koloni. Ketika dalam cawan terdapat koloni kurang dari 25, maka dalam pelaporannya dikatakan bahwa jumlahnya 2.5x10 1 CFU/ml. Jika tidak ditemukan koloni dalam cawan hingga pengenceran terendah, maka pelaporannya sebanyak 1.0x 10 1 CFU/ml. Namun jika koloninya melebihi 250, maka pelaporannya dianggap sebagai TBUD (tidak bisa dihitung). Dengan demikian, hanya cawan yang jumlah koloninya berkisar 25 hingga 250 saja yang dapat dihitung sebagai jumlah koloni bakteri yang diinokulasikan. Analisis Fisik a. Rendemen (AOAC 2005) Rendemen merupakan perbandingan antara bobot hasil akhir dengan bobot bahan awal dikalikan 100%. Dalam penelitian ini dilakukan pengukuran terhadap rendemen tersosoh dan rendemen tepung. Rendemen tersosoh merupakan persentase jumlah biji sorgum sosoh yang dihasilkan dari penyosohan sejumlah biji sorgum yang ditentukan dengan rumus berikut:
21 Rendemen tepung merupakan persentase jumlah tepung sorgum yang dihasilkan dari penepungan sejumlah biji sorgum sosoh yang ditentukan dengan rumus: b. Derajat Putih Tepung (Whiteness meter) Derajat putih diukur dengan menggunakan alat KETT Digital Whiteness Meter Model C-100. Sejumlah sampel dimasukkan ke dalam wadah sampel hingga tidak terdapat rongga, kemudian wadah sampel ditutup. Masukkan wadah berisi MgO 3 ke dalam alat sebagai standar. Selanjutnya keluarkan wadah berisi MgO 3 dan masukkan wadah berisi sampel ke dalam alat. Persentase derajat putih sampel ditentukan dengan menggunakan persamaan berikut: c. Kapasitas Menyerap Air dan Minyak (Elkhalifa et al. 2005) Tabung sentrifuse yang telah ditimbang beratnya lalu diisi dengan 2 g sampel (a), kemudian tambahkan 20 ml aquades untuk pengukuran kapasitas menyerap air dan 20 ml minyak untuk pengukuran kapasitas menyerap minyak lalu divortex. Selanjutnya diamkan selama 30 menit lalu disentrifuse dengan kecepatan 4000 rpm selama 25 menit dan didekantasi, kemudian ditimbang beratnya (b). Daya serap air/minyak dihitung dengan menggunakan persamaan: b a 10000 Daya serap air/minyak (%) = a (100 kadar air)
22 d. Profil Pasting Tepung (RVA) (Sanchez-Rivera et al. 2010) Profil pasing tepung diukur dengan menggunakan alat Rapid Visco Analyzer (RVA). Sampel ditimbang langsung di dalam tabung sampel aluminium RVA sebanyak 2.24 g dengan kadar air 8% db, dan aquades ditambahkan kedalamnya hingga berat total sampel 28 g. Jika kadar air sampel berbeda maka jumlah aquades yang ditambahkan harus disesuaikan dengan jumlah kadar air sehingga berat akhir sampel dalam tabung aluminium tetap konstan 28 g. Selanjutnya, campuran tersebut diaduk rata menggunakan paddle plastik untuk menghindari pembentukan gumpalan sebelum dimasukan ke dalam RVA. Sampel tersebut dimasukkan pada alat RVA dan dilakukan analisis. Selanjutnya, dilakukan siklus pemanasan dan pendinginan dengan pengadukan konstan yang diatur selama 23 menit. Sampel dipanaskan hingga suhu 30 C dan dipertahankan selama 1 menit. Kemudian sampel dipanaskan lagi hingga suhu 95 C selama 7.5 menit, lalu suhu 95 C dipertahankan selama 5 menit sebelum didinginkan hingga suhu 50 C selama 7.5 menit, lalu suhu 50 C dipertahankan selama 2 menit. Parameter yang diamati adalah suhu awal gelatinisasi, viskositas maksimum (peak viscosity), viskositas pada suhu 95 C (HPV), viskositas pada suhu 50 C (CPV), breakdown (BD) (1/4 PV-HPV), dan setback (SB) (1/4 CPV- HPV). e. Bentuk dan Ukuran Granula Tepung (Sanchez-Rivera et al. 2010) Bentuk dan ukuran dan bentuk granula tepung diukur dengan menggunakan Scanning Electron Microscope (SEM) s-3000n. Sebanyak 2 mg sampel ditaburkan setipis mungkin di atas wadah logam yang telah diberikan perekat. Penaburan sampel setipis mungkin bertujuan agar gambar granula yang diperoleh tidak saling bertumpuk. Selanjutnya dilapisi dengan menggunakan emaspalladium (60:40). Proses pelapisan bertujuan menjadikan sampel bersifat konduktif. Setelah itu, bentuk dan ukuran granula difoto dan diukur dengan menggunakan alat Scanning Electron Microscope (SEM) s-3000n. Sifat birefringence granula pati diukur dengan menggunakan mikroskop polarisasi. Tepung dibuat suspensi encer dengan melarutkan 1 sudip sampel dalam ±20 ml aquades. Setelah itu, diteteskan beberapa tetes suspensi ke atas sebuah gelas objek. Gelas penutup dipasang, lalu preparat diamati dengan menggunakan
23 mikroskop polarisasi cahaya dengan perbesaran 400 kali dan gambar yang teramati dipotret dengan kamera dan foto granula pati yang dihasilkan dicetak pada film. Analisis Kimia a. Kadar Tanin (AOAC 2005) Kadar tanin ditentukan dengan metode spektrofotometer yaitu membuat kurva standar sebelumnya dengan cara mengambil masing-masing 0-10 ml larutan asam tanin standar, kemudian dimasukan ke dalam labu ukur 100 ml yang berisi 75 ml aquades. Setelah itu, ditambahkan 5 ml reagen Folin-Denis dan 10 ml larutan Na 2 CO 3 lalu tambahkan aquades hingga tanda tera, kemudian diamkan selama 30 menit dan ukur menggunakan sprektrofotometer pada panjang gelombang 760 nm. Data yang diperoleh kemudian dibuat kurva standar. Setelah itu, sampel diukur dengan prosedur yang sama dengan menggantikan tannin stadard dengan 1 ml sampel. b. Kadar Air (AOAC 2005) Kadar air diukur dengan menggunakan metode oven yaitu suhu oven diatur 105 o C dan sampel dikeringkan di dalamnya sampai dicapai berat konstan. Persen kadar air berdasarkan berat basah dihitung dengan rumus berikut : c. Kadar Lemak (AOAC 2005) Kadar lemak diukur dengan menggunakan metode Soxhlet dengan prinsip lemak diekstrak dengan pelarut lemak (heksan), setelah pelarutnya diuapkan, lemak dapat ditimbang dan dihitung persentasenya berdasarkan rumus berikut : d. Kadar Protein (AOAC 2005) Sampel ditimbang dalam labu Kjeldahl lalu ditambahkan 2 g K 2 SO 4, 50 mg HgO dan 2 ml H 2 SO 4 pekat. Jika sampel lebih dari 15 mg, 0.1 H 2 SO 4 pekat ditambahkan untuk setiap 10 mg sampel di atas 15 mg. Sampel dididihkan selama
24 1-1.5 jam sampai cairan menjadi jernih. Kemudian didinginkan, ditambahkan sedikit air secara perlahan-lahan dan didinginkan lagi. Isi labu dipindahkan ke dalam alat destilasi dan dibilas 5-6 kali, air cucian dipindahkan ke dalam alat destilasi ditempatkan erlenmeyer 125 ml berisi 5 ml larutan borat jenuh dan 2-4 tetes indikator (metal merah + metal biru) di bawah kondensor. Ujung tabung kondensor harus terendam di bawah larutan asam borat jenuh. Kemudian ditambahkan 8-10 ml larutan NaOH-Na 2 S 2 O 3 lalu didestilasi sampai tertampung kira-kira 15 ml destilat dalam erlenmeyer. Tabung kondensor dan isi erlenmeyer dititrasi dengan HCl 0.1 N sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu atau biru. Kadar protein yang diperoleh dapat dihitung dengan cara berikut : Protein (% bk) = % N x faktor konversi (6.25) e. Kadar Abu (AOAC 2005) Sampel ditimbang dalam cawan pengabuan kemudian dibakar dalam tanur (550 o C) sampai diperoleh abu berwarna abu-abu atau sampai beratnya tetap. f. Kadar Karbohidrat (By different) Penetapan karbohidrat dilakukan dengan perhitungan berikut: Karbohidrat (% bk) = 100 (Protein + Lemak + Air + Abu) g. Kadar Pati (Funami et al. 2005) Sampel sebanyak 0.2 g dilarutkan dalam etanol 85%, lalu endapannya ditambahkan 25 ml aquades dan 6.5 ml asam perklorat dan diaduk. Setelah itu, dipanaskan dalam waterbath selama 30 menit, kemudian didinginkan, dinaikkan ph hingga 7-7.5, dan disaring. Tepatkan hasil saringan hingga 100 ml, lalu diambil 1 ml dan ditambahkan dengan 1 ml aquades dan 1 ml pereaksi DNS. Kemudian dipanaskan kembali selama 10 menit di dalam waterbath, didinginkan dan ditambahkan 3 ml aquades, lalu diukur absorbansinya menggunakan
25 spektrofotometri dengan panjang gelombang 540 nm. Jumlah pati pada tepung sorgum dihitung dengan interpolasi dari nilai absorbansi di kurva standar. Kurva standar dibuat dengan menggunakan maltosa sebagai standar. h. Kadar Amilosa (Funami et al. 2005) Sampel dalam bentuk tepung dilarutkan dalam 9 ml NaOH 1 N dan 1 ml etanol lalu dipanaskan selama 30 menit. Ambil 5 ml lalu tambahkan 1 ml CH 3 COOH 1 N dan 2 ml KI iod. Kemudian tepatkan pada labu takar 100 ml, lalu didiamkan selama 30 menit dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Jumlah amilosa dalam pati dihitung dengan interpolasi dari nilai absorbansi di kurva standar. Kurva standar dibuat dengan menggunakan campuran amilosa dari pati kentang sebagai standar. i. Kadar Amilopektin (Funami et al. 2005) Penetapan jumlah amilopektin ditentukan berdasarkan selisih antara jumlah pati dan jumlah amilosa yang dirumuskan sebagai berikut: Amilopektin (% bk) = Pati (% bk) Amilosa (% bk)