17 III. METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Lingkungan Departemen Budidaya Perairan, Institut Pertanian Bogor dan dilaksanakan selama 3 (tiga) bulan dimulai dari bulan Februari sampai Mei 2011. Untuk analisis gambaran darah dan glukosa darah dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan (LKI) Departemen Budidaya Perairan,Institut Pertanian Bogor. 3.2 Pelaksanaan Penelitian Penelitian dilaksanakan dalam dua tahapan yaitu : uji akut dan uji sub kronis. Ikan uji yang digunakan adalah juvenil ikan kerapu macan (Epinephelus fuscogutattus) berukuran 6-7 cm yang diperoleh dari Balai Benih Situbondo Jawa Timur sedangkan pakan yang digunakan adalah pelet ( komersil) dan logam berat timbal yang digunakan adalah timbal nitrat (Pb(NO 3 ) 2 ) yang diperoleh di toko Setia Guna Bogor. Wadah yang digunakan dalam penelitian ini berupa akuarium 20 x 20 x 30 cm, ukuran 30 x 30 x 30 cm, refraktometer, DO meter, ph meter, termometer dan gelas ukur. 3.3 Uji Akut Uji akut dilakukan berdasarkan konsentrasi yang diperoleh pada uji nilai kisaran kemudian ditentukan konsentrasi untuk perlakuan uji akut berdasarkan deret angka sebagai berikut: Perlakuan A = Tanpa Perlakuan timbal Perlakuan B = 20 ppm Perlakuan C = 40 ppm Perlakuan D = 80 ppm Perlakuan E = 160 ppm Pada tahap ini digunakan 150 ekor hewan uji dengan kepadatan ikan uji 10 ekor dalam setiap unit percobaan dengan 3 kali ulangan. Selama uji akut pada akuarium diberi aerasi kecil, feses dan sisa pakan di dasar akuarium disipon setiap hari. Pengamatan terhadap tingkah laku dan mortalitas ikan uji dilakukan setiap 2
18 jam selama 24 jam kemudian dilanjutkan tiap 6 jam selama 96 jam. Indikator pengamatan tingkah laku ikan uji yaitu gejala Ram Jet Ventilation (mulut terbuka secara terus menerus, dan tutup ikan terabduksi), frekuensi pernapasan yaitu gerak membuka dan menutup insang/mulut per menit (perhitungan dimulai 30 menit setelah pemberian bahan uji, dan selanjutnya dibandingkan dengan kontrol), pola gerak renang dan refleksi (normal, diam di dasar, ke permukaan, tidak seimbang, terkejut-kejut atau kehilangan gerak reflex) dan perubahan warna sisik. Penghitungan gerak operculum akan dimulai 30 menit setelah pemberian bahan uji, penghitungan akan dilakukan selama 1 menit dan diulangi setiap 10 menit sampai menit ke 30. Pengukuran kualitas air media pada setiap unit percobaan dilakukan pada jam ke-0, 24, 48, 72 dan ke-96. 3.4 Uji sub-kronik Penelitian ini akan dilakukan untuk melihat pengaruh konsentrasi timbal terhadap tingkat konsumsi oksigen (TKO), Kondisi hematologi, Kelangsungan hidup dan laju pertumbuhan. Uji ini dilakukan dengan 4 perlakuan dan 3 ulangan yaitu : Perlakuan A = Tanpa timbal (sebagai kontrol) Perlakuan B = 1 % dari LC 50-96 jam Perlakuan C = 5 % dari LC 50-96 jam Perlakuan D = 10 % dari LC 50-96 jam Pada tahap ini digunakan ikan uji sebanyak 240 ekor dengan masingmasing unit sebanyak 20 ekor. Percobaan dirancang dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), Uji pengaruh logam timbal ini dilakukan selama 30 hari. Variabel yang diamati adalah : Tingkat Konsumsi Oksigen, glukosa darah, respon hematologi (hematokrit, hemoglobin, eritrosit dan leukosit), kelangsungan hidup, laju pertumbuhan, kandungan logam berat timbal dalam daging ikan dan air laut serta pengukuran parameter kualitas air.
19 3.4.1 Tingkat Konsumsi Oksigen Tingkat konsumsi oksigen diukur dengan menggunakan botol respirasi pada akhir penelitian dengan menghitung rasio oksigen terlarut pada awal dan akhir pengamatan. Tingkat konsumsi oksigen dihitung menggunakan rumus Liao dan Huang (1975) : TKO = { (DO awal DO akhir)/w x t} x V Keterangan : TKO = Tingkat Konsumsi Oksigen (mg O 2 /gr tubuh/jam) DO awal = Oksigen terlarut pada awal pengamatan (mg/l) DO akhir = Oksigen terlarut pada akhir pengamatan (mg/l) W = Berat Ikan Uji (gr) t = periode pengamatan (jam) V = Volume air pada respirometer (L) 3.4.2 Kadar Glukosa Darah Pemeriksaan kadar glukosa darah ikan dilakukan sebagai indikator stress sekunder akibat toksisitas Timbal. Pengukuran kadar glukosa darah ini sebanyak 4 kali yaitu pada hari ke 0, 10, 20 dan hari ke-30. Sebelum pengambilan darah, ikan dipuasakan selama 24 jam. Prosedur pengukuran glukosa darah yaitu: plasma darah diambil dengan cara disentrifuge, selanjutnya 0,05 ml plasma darah, glukosa standard dsan akuades dimasukkan kedalam masing-masing tabung reaksi yang telah berisi 3,5 ml color reagent (perbandingan asam asetat dan ortotoluidine = 94:6). Setelah itu dipanaskan dalam water bath tertutup selama 10 menit pada suhu 100 ⁰C. Selanjutnya setelah didinginkan pada suhu kamar, lalu dibaca dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 635 nm. Rumus yang digunakan adalah : GD = Au x Cs As Keterangan : GD : Konsentrasi Glukosa darah (mg/100 ml) Au : Absorbansi sampel Cs : Konsentrasi standar As : Absorbansi standar
20 3.4.3 Gambaran Darah Pengukuran kadar hematokrit Prosedur pengamatan dan penghitungan kadar hematokrit dilakukan menurut Anderson dan Swicki (1993). Menggunakan Microhematocrit method, darah dimasukkan kedalam tabung mikrohematokrit sampai 4/5 bagian. Kemudian salah satu ujung tabung disumbat dengan crestaseal. Darah disentrifuge selama 5 menit. Setelah itu akan terbentuk lapisan-lapisan yang terdiri dari lapisan plasma yang jernih dibagian atas, kemudian lapisan putih abu-abu (buffy coat) yang merupakan trombosit dan leukosit dan lapisan eritrosit yang berwarna merah. Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur presentase volume eritrosit dari darah dengan menggunakan alat ukur panjang (mistar) dan dinyatakan dalam persentase (% Ht). Pengukuran kadar hemoglobin (Hb) Pengukuran kadar hemoglobin pada prinsipnya adalah mengkonversikan haemoglobin dalam darah kedalam bentuk asam hematin oleh asam klorida. Mulamula darah dihisap dengan menggunakan pipet sahli hingga skala 20 mm 3. Kemudian dipindahkan kedalam tabung Hb yang berisi HCl 0,1N sampai skala 10 (garis kuning). Didiamkan selama 3-5 menit agar Hb bereaksi dengan HCl membentuk asam hematin, kemudian diaduk dan ditambahkan aquadestila (sedikit demi sedikit) hingga warnanya sama dengan standar. Pembacaan skala dilakukan dengan melihat tinggi permukaan larutan yang dikocok dengan skala % yang menunjukkan banyaknya Hb dalam gram setiap ml darah dan dinyatakan dalam persentase (%Hb). Penghitungan jumlah sel darah merah (eritrosit) Prosedur pengamatan dam penghitungan jumlah sel darah merah pada penelitian ini berdasarkan Blaxhall dan Daisley (1973). Darah diambil dari ikan dengan menggunakan ineksi yang berisi cairan antikoagulan untuk mencegah terjadinya penggumpalan darah. Darah yang tersedot dimasukkan kedalam ependorf kemudian darah dihisap menggunakan pipet pencampur sampai pada skala 0,5 dan ditambahkan larutan Hayems yang dihisap dengan pipet yang sama hingga mencapai skala 101. Setelah itu, pipet digoyang membentuk angka delapan selama 3-5 menit. Tetesan pertama dibuang dan tetesan berikutnya diteteskan
21 kedalam hemositometer dan ditutup dengan kaca penutup. Penghitungan dilakukan pada 5 kotak kecil yaitu pada sudut kiri atas, sudut kanan atas, sudut kiri bawah, sudut kanan bawah dan pada bagian tengah. Jumlah sel darah merah yang terhitung dikonversikan dengan rumus: Jumlah sel darah merah = sel darah merah terhitung x 10 4 sel/mm 3 Penghitungan jumlah sel darah putih (leukosit) Prosedur pengamatan dan penghitungan jumlah sel darah putih dilakukan berdasarkan Blaxhall dan Daisley (1973). Metode pengambilan darahnya sama dengan metode pengambilan sel darah merah. Darh dihisap dengan pipet pencampur sampai dengan skala 11. Jumlah sel darah putih yang terhitung dikonversikan berdasarkan rumus: Jumlah sel darah putih = sel darah putih terhitung x 50 sel/mm 3 3.5 Kelangsungan Hidup Kelangsungan hidup ikan kerapu macan ditentukan dengan menggunakan rumus (Zonneveld et al., 1991) St = (Nt/No) 100 % Dimana : Sr = Kelangsungan Hidup (%) Nt = Jumlah hewan uji pada akhir penelitian (ekor) No= Jumlah hewan uji pada awal penelitian (ekor) 3.6 Laju Pertumbuhan Pertumbuhan ikan yang diukur meliputi pertambahan berat (g) dengan menggunakan neraca digital dan pertambahan panjang (cm) dengan menggunakan millimeter blok. Pengukuran ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh kadar timbals terhadap laju pertumbuhan juvenil ikan kerapu macan (Epinephelus fuscogutattus) menggunakan rumus sebagai berikut (Huisman, 1976) : α = { t [(Wt/Wo) 1] } x 100% Keterangan : Wt = Rerata bobot individu pada akhir penelitian Wo = Rerata bobot individu pada awal pemeliharaan (g)
22 t = Waktu pemeliharaan (hari) α = Laju pertumbuhan harian (g/hari) 3.7 Analisis Data Pengaruh logam berat timbal pada berbagai konsentrasi terhadap tingkat konsumsi oksigen, respon hematologi (kadar hematokrit, kadar hemoglobin, jumlah eritrosit, dan jumlah leukosit), kelangsungan hidup dan pertumbuhan pada ikan kerapu macan diperoleh dengan cara mengolah data menggunakan analisis sidik ragam, Apabila terdapat pengaruh yang nyata maka dilanjutkan dengan uji BNJ (Steel and Torrie, 1982). Parameter pendukung dianalisis dengan statistik deskriptif berupa tabel, grafik dan gambar. Pengolahan data menggunakan bantuan program Microsoft Excel 2007 dan SPSS 17.0.