FLAVONOID BUAH ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC) SEBAGAI ANTIOKSIDAN DAN INHIBITOR α-glukosidase SOFYAN GULTOM SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Flavonoid Buah Andaliman (Zanthoxylum acantopodium DC.) sebagai Antioksidan dan Inhibitor α- glukosidase adalah karya saya dengan arahan dari Komisi Pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, 02 Agustus 2011 Sofyan Gultom NIM G451090201
ABSTRACT SOFYAN GULTOM. Flavonoid of Zanthoxylum achanthopodium Fruit as an Antioxidant and α-glucosidase Inhibitors. Under direction of IRMA HERAWATI SUPARTO and IRMANIDA BATUBARA. Diabetes Mellitus could be caused by the presence of free radicals which damaged the pancreas cell membrane. Previous research showed that extract of andaliman (Zanthoxylum acantophodium DC.) fruit possessed activity as antioxidant. However, there has been no scientific report concerning its activities as antidiabetic. The main objective of this research was to evaluate the in vitro mechanism of Z. acantophodium fruit extract as antioxidant and α-glucosidase inhibitor. Andaliman macerated by four solvents, namely n-hexane, ethyl acetate, methanol and water, as solvent for extraction. Antioxidant activity was measured by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2-azinobis -3- ethylbenzathiazolin -6-sulfonic acid (ABTS) method, and inhibition of enzyme α-glucosidase using substrate p-nitrofeyl-α-d-glucopyranoside. Results of this research showed that methanol extract had the highest activities, both as antioxidant and α-glucosidase inhibitor. This extract was separated by column chromatography yielded six fractions (A-F). The most active fraction as α-glucosidase inhibitor was fraction C and for antioxidant was fraction E. These two fractions were further separated using preparative thin layer chromatography. The best antioxidants with DPPH method was fraction E2 (IC 50 137.46 ppm), for ABTS method was crude methanol extract (IC 50 30.04 ppm), while for α-glucosidase inhibitors was the fraction C (IC 50 16 ppm). Based on the results of data analysis by Infrared and UV-Vis, showed that the main active compound contained in fraction C2 and E2 were the of aurones and flavanones of flavanoid group. Keywords: Zanthoxylum acanthopodium DC, antidiabetic, antioxidant, inhibitor α-glukosidase, flavonoid.
RINGKASAN SOFYAN GULTOM. Flavonoid Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC) sebagai Antioksidan dan Inhibitor Enzim α-glukosidase. Dibimbing oleh IRMA HERAWATI SUPARTO dan IRMANIDA BATUBARA. Diabetes Melitus (DM) merupakan penyakit berbahaya yang ditandai dengan hiperglikemia, yaitu meningkatnya kadar gula darah hingga melebihi normal (80-120 mg/dl). Hiperglikemia umumnya disebabkan oleh rusaknya sel pankreas sehingga kerja insulin tidak bisa berfungsi dengan maksimal. Di dalam tubuh terdapat enzim α-glukosidase yang berfungsi untuk menghidrolisis karbohidrat menjadi gula sederhana (glukosa) pada usus. Pada intinya, penyakit ini disebabkan rusaknya sel dan kadar gula yang berlebih, oleh karena itu asupan antioksidan dan hambatan kerja enzim α-glukosidase merupakan solusi yang tepat untuk mengatasi penyakit ini, karena antioksidan akan mereduksi radikal bebas sebagai pemicu rusaknya sel-sel dalam tubuh, begitu juga dengan menghambat kerja enzim α-glukosidase akan memperkecil produksi glukosa pada usus. Flavonoid adalah salah satu senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan dan obat antidiabetes. Senyawa flavonoid telah banyak diisolasi dari bahan alam. Buah andaliman salah satu tanaman yang mengandung senyawa tersebut. Secara ilmiah buah andaliman mengandung senyawa bioaktif yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan dan antibakteri. Berdasarkan data ilmiah tersebut perlu dikaji lebih lanjut mengenai mekanisme buah andaliman sebagai antihiperglikemia, apakah karena sifat antioksidasinya atau sebagai inhibitor α-glukosidase, yaitu enzim yang berperan dalam penyerapan glukosa di usus sehingga kadar glukosa di dalam darah dapat diturunkan. Penelitian ini dilakukan untuk menguji aktivitas antioksidan senyawa flavonoid buah andaliman dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrihydrazyl), dan ABTS (Asam 2,2-azinobis-3-etilbenzatiazolin-6-sulfonat) dan menguji aktivitas inhibitor enzim α-glukosidase. Sampel yang di uji terdiri atas: ekstrak buah andaliman dengan pelarut n-heksana, etilasetat, metanol, dan air, fraksi dari hasil pemisahan dengan kolom dan fraksi dari hasil pemisahan dengan Kromatograpi Lapis Tipis Preparatif (KLTP). Fraksi teraktif dari hasil pemisahan dengan KLTP dianalisis dengan UV-Vis (Ultraviolet-visible) dan Infrared (IR). Hasil penelitian ini menunjukkan, ekstrak yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan adalah ekstrak etilasetat, metanol dan air, sedangkan sebagai inhibitor α-glukosidase ekstrak yang aktif adalah ekstrak etilasetat dan metanol. Berdasarkan nilai IC 50, ekstrak metanol memiliki aktivitas paling tinggi sebagai antioksidan dan sebagai inhibitor α-glukosidase IC 50 sebagai berikut; antioksidan 390,92 ppm (metode DPPH), 30,04 ppm (metode ABTS), dan 323 ppm untuk inhibitor α-glukosidase. Dari proses fraksinasi dengan kromatografi kolom diperoleh enam fraksi (A-F), setelah diuji aktivitas, fraksi C memiliki aktivitas tertinggi sebagai inhibitor α-glukosidase dengan nilai IC 50 = 16 ppm dan fraksi E sebagai antioksidan dengan nilai IC 50 444,77 ppm (DPPH), dan 181,79 ppm (ABTS). Selanjutnya, fraksi C dan E difraksinasi lagi dengan KLTP dan diperoleh jumlah fraksi masing-masing yaitu untuk fraksi C sebanyak sepuluh fraksi (C1- C10) dan untuk fraksi E diperoleh delapan fraksi (E1-E8). Hasil uji aktivitas,
iii tertinggi sebagai inhibitor α-glukosidase adalah fraksi C2 dengan IC 50 34,72 ppm dan E2 adalah fraksi yang paling baik sebagai antioksidan dengan masing-masing nilai IC 50 sebesar 137,46 ppm (DPPH), dan 74,02 ppm (ABTS). Berdasarkan data yang diperoleh hasil identifikasi UV-Vis dan IR, diduga senyawa aktif utama yang terkandung dalam fraksi C2 dan E2 yang berpotensi sebagai inhibitor α- glukosidase dan antioksidan adalah senyawa flavonoid golongan auron dan flavanon. Kata kunci: Andaliman, enzim α-glukosidase, antioksidan, diabetes, flavonoid.
Hak Cipta milik IPB, tahun 2011 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.
FLAVONOID BUAH ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC) SEBAGAI ANTIOKSIDAN DAN INHIBITOR α-glukosidase SOFYAN GULTOM Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Siti Sa diah, S.Si.M.Si.Apt.
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat dan karunia Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan dengan baik. Tak lupa penulis panjatkan shalawat beriring salam bagi teladan Nabi Muhammad SAW. Karya ilmiah ini berjudul Flavonoid Buah Andaliman (Zanthoxylum acantopodium DC) Sebagai Antioksidan dan Inhibitor α-glukosidase disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan mulai bulan Nopember 2010 hingga Juli 2011 di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, dan Laboratorium Kimia Analitik Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor (IPB). Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. dr. Irma herawati Suparto, MS dan Dr. Irmanida Batubara, SSi, MSi yang telah memberikan bimbingan dan saran selama pelaksanaan penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Kepada Direktur Jendral Departemen Agama, saya ucapkan terima kasih banyak yang telah mendanai penulis selama studi. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada orang tua, adik, abang yang telah memberi dukungan materi, non materi, dan do a kepada penulis dalam penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih penulis tujukan kepada teman-teman seperjuangan mahasiswa Pascasarjana Kimia angkatan 2009 yang selalu memberikan motivasi selama menjalani studi dan penelitian, dan pak Eman, ibu Nunung selaku staf Laboratorium Kimia Analitik FMIPA IPB, serta Mbak Salina, mbak Nunuk, Mas Endi, Mas Nio selaku staf laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB atas semua kerjasamanya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Agustus 2011 Sofyan Gultom
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tarutung pada tanggal 10 Desember 1976 dari ayah H. Ibrahim Gultom dan ibu Nurlela Munthe. Penulis merupakan anak keenam dari tujuh bersaudara. Tahun 1996, penulis terdaftar sebagai mahasiswa pada program sarjana, Jurusan kimia, Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan alam Institut Keguruan dan Ilmu Pendidikan (IKIP) Medan (sekarang Universitas Negeri Medan) dan menamatkannya pada tahun 2001. Penulis bekerja sebagi guru bidang studi kimia di Madrasah Aliyah Negeri (MAN) Binanga, Kecamatan Barumun Tengah, Kabupaten Padang Lawas, Propinsi Sumatera Utara mulai tahun 2004. Kesempatan untuk melanjutkan program pascasarjana S2 pada program studi yang sama diperoleh pada tahun 2009. Penulis diterima sebagai mahasiswa Pascasarjana, mayor kimia dengan biaya pendidikan dari Direktorat Jenderal Pendidikan Islam, Departemen Agama, Kementerian Agama Republik Indonesia melalui program beasiswa pascasarjana (S2) angkatan III Tahun 2009. Selama mengikuti perkuliahan di program S2, penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Kimia Dasar untuk mahasiswa Tingkat Perkuliahan Bersama (TPB) pada tahun ajaran 2010-2011.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... xii DAFTAR GAMBAR... xiii DAFTAR LAMPIRAN... xiv PENDAHULUAN... 1 Tujuan Penelitian... 2 Manfaat Penelitian... 2 Hipotesis... 2 TINJAUAN PUSTAKA... 3 Diabetes Melitus... 3 Aktivitas Inhibitor α-glukosidase... 3 Senyawa Antioksidan... 4 Metode Uji Aktivitas Antioksidan... 5 Flavonoid... 7 Andaliman... 8 METODOLOGI PENELITIAN... 11 Waktu dan Tempat... 11 Bahan dan Alat... 11 Metode Penelitian... 11 Preparasi Sampel... 11 Penentuan Kadar Air... 12 Penentuan Kadar Abu... 12 Ekstraksi Buah Andaliman... 12 Analisis Kualitatif Total Fenol... 13 Uji Fitokimia... 13 Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH dadn ABTS... 14 Uji Aktivitas Inhibitor α-glukosidase... 14 Penentuan Eluen Terbaik... 15 Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)... 16 Identifikasi Senyawa... 16 HASIL DAN PEMBAHASAN... 17 Persiapan dan Ekstraksi Sampel... 17 Uji Aktivitas dan Pemilihan Ekstrak Terbaik... 17 Pencarian Eluen Terbaik... 19 Fraksinasi Ekstrak Teraktif... 20 Pemilihan Fraksi Terbaik Hasil Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom... 21 Fraksinasi Fraksi Terbaik dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif... 23 Pemilihan Fraksi Terbaik Hasil Fraksinasi dengan Kromatografi
xi Lapis Tipis Preparatif... 24 Identifikasi dan Pendugaan Senyawa Aktif... 25 SIMPULAN DAN SARAN... 29 DAFTAR PUSTAKA... 31 LAMPIRAN... 33
DAFTAR TABEL Halaman 1 Hasil uji fitokimia ekstrak kasar buah andaliman... 18 2 Uji total fenol, dan IC 50 aktivitas ekstrak kasar andaliman... 18 3 Data IC 50 aktivitas fraksi hasil fraksinasi dengan kromatografi kolom... 22 4 Uji fitokimia dan IC 50 aktivitas ekstrak fraksi hasil kromatografi kolom... 23 5 Nilai IC 50 aktivitas untuk fraksi hasil fraksinasi dengan kromatograpi lapis tipis preparatif (KLTP)... 24 6 Serapan infra merah gugus fungsi fraksi C2 dan E2... 27 7 Nilai panjang gelombang maksimum senyawa dalam fraksi C2 dan E2... 27
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Struktur troloks... 5 2 Reaksi antara DPPH dan antioksidan dalam pembentukan DPPH.. 5 3 Reaksi pembentukan radikal bebas stabil ABTS... 6 4 Konfigurasi C6-C3-C6 kerangka dasar flavonoid... 7 5 Daun dan buah andaliman... 8 6 Profil eluen terbaik dengan pelarut tunggal... 20 7 Profil eluen terbaik dengan perbandingan cloroform dan metanol... 20 8 Profil KLT fraksi hasil fraksinasi dengan kolom... 21 9 Profil spot fraksi hasil fraksinasi dengan KLTP... 23 10 Spektrum Inframerah fraksi E2 dan C2... 26
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Diagram alir penelitian... 34 2 Determinasi tanaman andaliman... 36 3 Penentuan rendemen ekstrak kasar... 37 4 Penentuan total fenol... 38 5 Perhitungan IC 50 ekstrak kasar buah andaliman untuk uji aktivitas antioksidan dan inhibitor α-glukosidase... 39 6 Nilai Rf setiap tabung hasil fraksinasi ekstrak metanol dengan kolom... 41 7 Nilai Rf dan penentuan rendemen setiap fraksi dari hasil penggabungan setiap tabung dari fraksinasi dengan kromatografi kolom... 42 8 Contoh perhitungan IC 50 fraksi hasil fraksinasi dengan kromatografi kolom... 43 9 Nilai rendemen dan Rf fraksi hasil fraksinasi dengan kromatografi lapis preparatif... 45 10 Perhitungan IC 50 fraksi yang diperoleh dari hasil fraksinasi dengan kromatografi lapis tipis preparatif... 46
PENDAHULUAN Diabetes Melitus (DM) adalah penyakit metabolit yang ditandai dengan hiperglikemia, yaitu meningkatnya kadar gula darah yang melebihi kadar normal (80-120 mg/dl), umumnya disebabkan oleh malfungsi sekresi insulin atau kerja insulin yang tidak memadai (Lee 2007). Penderita DM di Indonesia menempati urutan keempat setelah Amerika Serikat, India, dan Cina (Mistra 2004). Oleh karena itu, diperlukan suatu penanganan dan cara pengobatan yang efektif tanpa menimbulkan efek samping yang besar. Salah satu alternatif pendekatan yang dapat dilakukan adalah mencegah hidrolisis karbohidrat menjadi gula sederhana (glukosa) pada usus dengan cara menghambat enzim α-glukosidase, sehingga menghambat peningkatan gula darah pascamakan (postprandial) dan menghambat terjadinya pembentukan radikal bebas dengan antioksidan (Alfarabi 2010). Antioksidan adalah suatu senyawa yang dalam konsentrasi rendah dibandingkan dengan substrat yang dapat teroksidasi, secara signifikan atau mencegah radikal bebas dan menghambat reaksi oksidasi substrat yang dipicu oleh oksigen atau peroksida. Kebanyakan tumbuhan yang mengandung senyawa bioaktif seperti glikosida, alkaloid, terpenoid, dan flavonoid mempunyai aktivitas sebagai antioksidan dan antidiabetes (Suarsana et al. 2008). Buah andaliman merupakan salah satu jenis rempah yang belum banyak dikenal oleh masyarakat Indonesia. Penelitian mengenai buah tersebut masih sangat terbatas sehingga tidak banyak publikasi atau data ilmiah yang dapat diperoleh (Wijaya 1999). Dari uji fitokimia yang dilakukan oleh Tensiska et al. (2001), buah andaliman positif mengandung senyawa flavonoid dan polifenol yang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan melalui uji antioksidan dengan metode ransimat. Flavonoid juga dilaporkan memiliki aktivitas penghambat terhadap enzim α-glukosidase seperti pada ekstrak metanol tempe (Suarsana et al. 2008). Aktivitas penghambat enzim α-glukosidase dan antioksidan adalah dua hal yang berpengaruh terhadap penyakit diabetes mellitus. Berdasarkan pada latar belakang tersebut, selain sebagai antioksidan, potensi buah andaliman sebagai inhibitor enzim α-glukosidase menarik dan perlu
2 untuk diteliti. Identifikasi komponen aktifnya juga perlu dilakukan dengan spektrofotometer ultraviolet-visible (UV-Vis) dan inframerah (IR). Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini untuk mengidentifikasi senyawa flavonoid buah andaliman sebagai antioksidan dengan metode 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) dan asam 2,2-azinobis-3-etilbenzatiazolin-6-sulfonat (ABTS), serta aktivitasnya sebagai inhibitor enzim α-glukosidase secara in vitro. Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang potensi senyawa flavonoid buah andaliman sebagai antioksidan dan inhibitor α- glukosidase, serta dapat digunakan sebagai salah satu alternatif untuk pengobatan diabetes. Hipotesis Berdasarkan uraian di atas, maka hipotesis yang diajukan pada penelitian ini ialah senyawa flavonoid dari buah andaliman berpotensi sebagai antioksidan serta mampu menghambat enzim α-glukosidase secara in vitro.
3 TINJAUAN PUSTAKA Diabetes Melitus Diabetes Melitus salah satu penyakit komplikasi yang sangat berbahaya. Komplikasi yang dapat disebabkan penyakit ini adalah penyakit jantung, koroner, stroke, kebutaan, gagal ginjal, neuropatik, dan luka yang sulit sembuh sampai mengalami pembusukan. Umumnya penyakit ini disebabkan oleh malfungsi sekresi insulin atau kerja insulin yang tidak memadai (resistensi insulin). Hiperglikemia kronis pada penderita diabetes biasanya berhubungan dengan disfungsi/kerusakan sel-sel beta pankreas. Salah satu penyebab kerusakan sel-sel beta pankreas adalah radikal bebas atau infeksi virus (Suarsana et al. 2008). Menurut Suyono (2002), fungsi organ pankreas ialah sebagai penghasil hormon insulin. Penyakit DM dibagi menjadi dua tipe, yaitu tipe 1 dan tipe 2. Penyakit DM tipe 1 bergantung pada insulin, peningkatan kadar glukosa darah akibat kurangnya kelenjar pankreas mensekresikan hormon insulin. Hormon insulin yang dihasilkan tidak mencukupi untuk mengubah glukosa darah menjadi glukosa intraseluler. Hal ini disebabkan karena sebagian besar sel beta pankreas yang memproduksi insulin mengalami kerusakan sehingga kadar insulin menjadi kurang dan tidak ada. Penyakit DM tipe 2 tidak bergantung pada insulin, jumlah insulin normal bahkan melebihi jumlah batas normal, tetapi jumlah reseptor insulin yang terdapat pada permukaan sel kurang sehingga glukosa ke dalam sel terhambat. Keadaan ini akan menyebabkan meningkatnya kadar glukosa darah dan menurunnya kadar glukosa intraseluler. Penyakit ini disebabkan oleh obesitas, diet tinggi lemak, karbohidrat, dan kurang gerak badan sehingga tidak dapat memproduksi insulin yang menyebabkan kadar gula darahnya naik. Aktivitas Inhibitor Enzim α-glukosidase Enzim α-glukosidase adalah suatu biokatalisator yang berfungsi untuk meningkatkan hidrolisis karbohidrat menjadi glukosa (gula sederhana) di usus. Senyawa yang dapat menghambat aktivitas tersebut sangat berpotensi sebagai obat antidiabetes karena dapat menurunkan kadar gula darah dengan cara memperlambat penyerapan karbohidrat postprandial (Suarsana et al. 2008).
4 Enzim ini terlibat dalam degradasi glikogen dengan mengkatalisis hidrolisis residu glukosa yang berikatan α-1,4 pada berbagai substrat dan dihasilkan α-dglukosa. Enzim α-glukosidase menghidrolisis ikatan α-glukosidik pada oligosakarida dan α-d-glikosida. Enzim tersebut merupakan katalis pada langkah akhir pemecahan karbohidrat (Sou 2000). Inhibitor α-glukosidase menjadi obat umum yang sering digunakan untuk mengontrol postprandial hiperglikemia sejak diperkenalkan tahun 1990-an. Salah satu obat sintetiknya adalah akarbosa yang dapat mengurangi kadar gula dengan mengintervensi penyerapan sari pati dalam usus. Namun, kelemahan penggunaan obat sintetik ini yait dapat menyebabkan efek samping, misalnya kembung, diare, dan kram usus. Oleh karena itu, perlu diteliti peran dari bahan alam yang memiliki potensi tinggi sebagai penghambat aktivitas α-glukosidase dengan efek samping yang minimal seperti Saurhus chinensis, Commelina communis L, dan bunga Punica grantum (Lee 2007). Alfarabi (2010) melaporkan senyawa aktif dari daun sirih merah (Piper crocatum) dapat berpotensi sebagai antioksidan dan penghambat enzim α-glukosidase. Senyawa Antioksidan Berdasarkan fungsinya, antioksidan dikelompokkan menjadi antioksidan primer dan antioksidan sekunder. Antioksidan primer (antioksidan pemecah rantai), yaitu antioksidan yang dapat bereaksi dengan radikal lipid lalu mengubahnya ke bentuk yang lebih stabil, suatu molekul antioksidan disebut antioksidan primer (AH), apabila dapat mendonorkan atom hidrogennya secara cepat ke radikal lipid (RO ) dan radikal turunan antioksidan tersebut (A ) lebih stabil dibanding radikal lipid, atau mengubahnya ke bentuk yang lebih stabil. Antioksidan sekunder (antioksidan pencegah) didefinisikan sebagai suatu senyawa yang dapat memperlambat laju reaksi autooksidasi lipid. Antioksidan ini bekerja dengan berbagai mekanisme, seperti mengikat ion logam, menangkap oksigen, memecah hidroperoksida ke bentuk-bentuk non radikal, menyerap radiasi ultra violet atau mendeaktifkan singlet oksigen (Gordon 1990). Troloks Troloks merupakan analog vitamin E yang larut dalam air. Troloks memiliki nama International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) 6-
5 hidroksil-2,5,7,8- tetrametilkroman-2-asam karboksilat (Gambar 1). Berdasarkan metode ransimat troloks memiliki indeks kapasitas antioksidasi, yaitu empat. Senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan dapat dinyatakan sebagai Troloks Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) konsentrasi troloks yang memiliki kapasitas antioksidan ekivalen dengan sampel yang dianalisis (Apac et al. 2004). Gambar 1 Struktur troloks. Metode Uji Aktivitas Antioksidan Aktivitas antioksidan dapat ditentukan dengan beberapa metode seperti metode penangkapan radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), dan ABTS (asam 2,2-Azinobis-3-etilbenzatiazolin-6-sulfonat). Metode DPPH Metode ini menggunakan DPPH sebagai model radikal bebas, Senyawa yang aktif sebagai antioksidan mereduksi radikal bebas DPPH menjadi senyawa diphenil picryl hydrazyl (Amic et al. 2003) (Gambar 2). 2,2-diphenil-1-Pikryl hydrazyl Radikal bebas (DPPH ) 2,2-diphenil-1-Picryl hydrazyl (DPPH) Gambar 2 Reaksi antara DPPH dan antioksidan dalam pembentukan DPPH. Ketika larutan DPPH dicampur dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, maka warna ungu dari larutan akan hilang seiring dengan
6 tereduksinya DPPH oleh antioksidan. Absorban yang dihasilkan oleh hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan persen inhibisi. Prinsip metode ini adalah reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH dari zat antioksidan (Gambar 2). Metode ABTS Pereaksi ABTS merupakan substrat dari peroksidase, yang ketika ABTS dioksidasi dengan kehadiran H 2 O 2 akan terbentuk senyawa radikal kation metastabil. Suatu radikal ABTS stabil diproduksi dengan cara oksidasi kalium persulfat ABTS sebelum penambahan antioksidan (Gambar 3) dengan karakteristik menunjukkan absorbansi kuat pada panjang gelombang 414 nm. ABTS merupakan senyawa larut dalam air dan stabil secara kimia. Uji ABTS disebut juga uji radikal ABTS, telah banyak digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan komponen dalam makanan dan minuman karena dapat diterapkan pada fase air dan lipid. Gambar 3 Reaksi pembentukan radikal bebas stabil ABTS dari ABTS dengan potasium persulfat (kalium persulfat). (Rohim et al. 2008) Akumulasi dari ABTS dapat dihambat oleh antioksidan pada medium reaksi dengan aktivitas yang bergantung pada waktu reaksi dan jumlah antioksidan. Aktivitas antioksidan bahan alam, seperti karotenoid, senyawa fenolik dengan metode ABTS ini dapat diukur berdasarkan penghilangan warna (decolorization)
7 dari ABTS, yaitu mengukur absorbansi pengurangan radikal kation dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 734 nm sebagai persentase penghambatan. Flavonoid Flavonoid merupakan salah satu golongan fenol alam terbesar yang banyak ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan hijau. Diperkirakan 2 % dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh tumbuhan diubah menjadi flavonoid atau senyawa yang berkaitan dengannya (Markham 1988). Selanjutnya, Harborne (1987) menyebutkan bahwa sebenarnya flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan hijau, sehingga dapat ditemukan pada setiap telaah ekstrak tumbuhan. Flavonoid terdiri atas beberapa kelas antara lain, antosianin, flavonol, flavon, glikoflavon, iflavonil, flavanon, kalkon dan auron serta isoflavon. Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon dengan cincin benzena (C6) terikat pada suatu rantai propan (C3), membentuk konfigurasi C6-C3-C6, yang dapat menghasilkan 3 jenis struktur, yakni 1,2-diaril propan atau flavonoid, 1,2-diaril propan atau isoflavonoid, dan 1,2-diaril propan atau neoflavonoid (Gambar 4). A C 3 C 1 C 2 Flavonoid B A C 3 C 1 C 2 Isof la v onoid B A C 3 C 1 C 2 A O C 2 B B C 4 C 3 N eoflavonoid 2-f enilkroman Gambar 4 Konfigurasi C6-C3-C6 kerangka dasar flavonoid. Senyawa-senyawa flavonoid dapat mempunyai kerangka 2-fenilkroman, dimana posisi orto dari cincin A dan atom karbon yang terikat pada cincin B dari 1,3-diaril propan dihubungkan oleh jembatan oksigen, sehingga membentuk suatu cincin heterosiklik yang baru seperti pada Gambar 4 (Markham 1988). Telah
8 banyak penelitian yang dilakukan mengenai penggunaan senyawa flavonoid. Diantara senyawa-senyawa antioksidan alami, yang terpenting adalah senyawa golongan flavonoid. Suryanto et al (2004) melaporkan senyawa yang berpotensi sebagai penangkap radikal bebas (antioksidan) adalah fenolik (flavonoid). Beberapa studi in vitro menunjukkan aktivitas antioksidan flavonoid, yaitu mencegah bergabungnya oksigen dengan zat lain sehingga tidak menimbulkan kerusakan pada sel-sel tubuh. Senyawa flavonoid bersifat antibakteri, antiinflamasi, antialergi, antimutagen, antineoplastik, dan antitrombosit (Miller 1996). Senyawa aktif yang berpotensi sebagai antioksidan dan inhibitor α- glukosidase ekstrak daun sirih merah diduga kuat senyawa flavonoid (Alfarabi, 2010). Suarsana et al. (2008) melaporkan bahwa senyawa bioaktif pada ekstrak etanol tempe yang mampu menghambat kerja enzim α-glukosidase adalah isoflavon genistein. Andaliman Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC) adalah salah satu rempah yang digunakan masyarakat adat Batak Angkola dan Batak Toba dengan nama daerah Sinyar-nyar (Angkola) dan Andaliman (Toba). Tanaman ini tergolong perdu dengan tinggi 3-8 m, batang dan cabang merah kasar, berbulu halus dan berduri. Tumbuhan ini berasal dari daerah Himalaya subtropis. Di Indonesia, tumbuhan ini terdapat di Sumatera Utara dan ditemukan liar di pegunungan pada ketinggian 1400 m dpl, dengan temperatur 15-18 o C. (A) (B) Gambar 5 (A) daun dan (B) buah tanaman andaliman.
9 Buahnya bulat kecil berwarna hijau (Gambar 5), bila digigit mengeluarkan aroma yang wangi dan rasa tajam yang khas, serta dapat merangsang produksi air liur karena bersifat karminativum (Sirait 1992). Di tempat asalnya masyarakat Himalaya, Tibet dan sekitarnya, buah dari tanaman ini biasa digunakan sebagai bahan aromatik, tonik, perangsang nafsu makan, dan obat sakit perut. Klasifikasi tumbuhan andaliman menurut Keng (1978) adalah sebagai berikut: divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Dicotyledonae, ordo Eraniales, famili Rutaceae, marga Zanthoxylum, dan spesies Zanthoxylum acanthopodium DC. Hasil isolasi dan identifikasi senyawa getir yang dilakukan oleh Wijaya (2000), menunjukkan bahwa komponen getir yang berhasil diisolasi dari ekstrak petroleum eter dan alkohol merupakan senyawa terpenoid. Suatu komponen yang serupa dengan senyawa yang dikenal sebagai sanshol, yaitu suatu senyawa yang ditemukan pada Japanese pepper oil, dimana minyak ini merupakan hasil destilasi air tumbuhan sanshol (Z. pipperium DC). Parhusip (2006) melaporkan buah andaliman memiliki kadar lemak sebesar 2.58% (parhusip 2006).
10
11 METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan mulai bulan November 2010 sampai Juli 2011 di Laboratorium Kimia, Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat (LPPM) Institut Pertanian Bogor, serta Laboratorium Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong. Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah buah andaliman yang berasal dari Sumatera Utara (Medan). Bahan kimia yang dibutuhkan adalah pereaksi uji fitokimia, berbagai jenis pelarut organik teknis dan proanalis yang biasa digunakan seperti: n-heksana etanol, metanol, kloroform, etilasetat, akuades. enzim α-glukosidase, p-nitrofenil-α-d-glukopiranosida (PNG), tablet akarbosa (Glukobay), DPPH (1,1- diphenyl 2-ficrylhydrazyl), pereaksi ABTS (Asam 2,2- Azinobis (3-etilbenzatiazolin -6-sulfonat ) (Sigma), Folin Ciocalteu, asam galat, silika gel 60 (70-230 mesh) untuk kromatografi kolom, dan kertas Whatman 42. Alat yang digunakan adalah freeze drier, penggojong, rotavapor, Spektropotometer UV-Vis (Shimadzu model UV-160), Microplate reader, Pelat kromatografi lapis tipis (KLT), pelat kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP), silica gel 60 GF 254 ukuran 20 X 20 cm tabung reaksi, kolom ukuran; panjang 62 cm, diameter 2,5 cm, pipet mikro, spektroskopi Infrared (IR), vorteks, dan alatalat gelas untuk keperluan analisis. Metode Penelitian Persiapan Sampel Persiapan sampel dimulai dengan mencuci buah segar andaliman dengan air kran sebanyak dua kali, kemudian dikeringanginkan selama satu malam. Untuk mencegah terjadinya perubahan kimia, pengeringan dilanjutkan dalam oven pada suhu 40-60 o C. Setelah buah andaliman benar-benar kering yang ditandai dengan
12 warna hitam lalu dihaluskan sampai ukuran 80 mesh. Serbuk buah andaliman siap digunakan untuk analisis selanjutnya. Penentuan Kadar Air (AOAC 2006) Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105 o C selama 30 menit. Kemudian cawan didinginkan dalam eksikator. Sebanyak 3 g serbuk buah andaliman dimasukkan ke dalam cawan porselin dan dipanaskan dalam oven pada suhu 105 o C selama 3 jam, kemudian, cawan diangkat dan didinginkan dalam eksikator selama 30 menit. Cawan dengan serbuk sampel ditimbang hingga bobot konstan. Penentuan Kadar Abu Cawan porselin dikeringkan pada temperatur 600 o C selama 30 menit dan didinginkan dalam eksikator, kemudian ditimbang bobotnya. Sebanyak 2 g sampel ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan porselin. Cawan dan isinya dipanaskan dengan nyala bunsen sampai tidak berasap lagi. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam tanur listrik dengan temperatur 600 o C sampai contoh benar-benar menjadi abu (kira-kira 30 menit). Setelah didinginkan dalam eksikator, lalu cawan ditimbang. Hal ini dilakukan sebanyak tiga kali ulangan (triplo). Kadar abu dapat dihitung dengan rumus: Kadar abu = a Χ 100% b Keterangan: a = bobot abu b =bobot contoh Ekstraksi Buah Andaliman Ekstraksi yang dilakukan merujuk pada ekstraksi yang dilakukan Parhusip (2006) dan Yamazaki et al. (2007), yaitu ekstraksi dengan cara bertingkat. Sebanyak 951,15 g sampel serbuk kering dimaserasi dengan masing-masing 4 L pelarut non polar (n-heksana) untuk menghilangkan lipid dan memisahkan ekstrak non polar yang terkandung dalam andaliman. Ampas kering dari hasil penyaringan maserasi dengan pelarut n-heksana, dengan cara yang sama dimaserasi kembali dengan pelarut etilasetat untuk memperoleh ekstrak semipolar,
13 masing-masing dilakukan sampai 3 kali ulangan. Kemudian dilanjutkan maserasi dengan pelarut polar (metanol) dan air. Ekstrak hasil ekstraksi kemudian dilanjutkan dengan epavorasi. Selanjutnya ekstrak yang sudah dievaporasi dihitung rendemennya, diuji fitokimia, dan diuji aktivitas (antioksidan & inhibitor enzim α-glukosidase). Analisis Kualitatif Total Fenol Sebanyak 0,025 g ekstrak dilarutkan dengan 2 ml etanol dalam tabung reaksi dan ditambah 0,5 ml aquades 1 ml pereaksi Folin-Ciocalteu (50 %). Kemudian campuran ini divorteks selama 3 menit, kemudian ke dalam tabung ditambahkan 1 ml larutan Na 2 CO 3 5%. Selanjutnya campuran disimpan di tempat yang gelap selama 30 menit. Absorbansi ekstrak diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum (λ max). Hasilnya dinyatakan sebagai mg asam galat/100 g ekstrak. Larutan asam galat digunakan sebagai zat untuk membuat kurva kalibrasi. Uji Fitokimia (Harborne 1987) Uji flavonoid. Sebanyak 0,1 g ekstrak/serbuk andaliman ditambahkan 10 ml air panas kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 10 ml filtrat ditambahkan 0,5 g serbuk Mg, 1 ml HCl pekat, dan 1 ml amil alkohol. Campuran dikocok kuat-kuat. Uji positif ditandai dengan munculnya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol. Uji triterpenoid dan steroid. Uji ini menggunakan pereaksi Lieberman- Buchard. Pada pengujian ini, sebanyak 0,1 g serbuk/ekstrak andaliman dilarutkan dengan 25 ml etanol (50 ºC), disaring dan residu ditambahkan eter. Filtrat ditambahkan 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat secara berurutan. Larutan dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna merah atau ungu untuk triterpenoid serta hijau atau biru untuk steroid. Uji alkaloid. Sebanyak 0,1 g serbuk/ekstrak dilarutkan dengan 10 ml kloroform dan beberapa tetes NH 4 OH dan disaring ke dalam tabung reaksi tertutup. Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan penambahan 10
14 tetes H 2 SO 4 2 M kemudian lapisan asamnya dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada pelat tetes dan ditambahkan pereaksi Meyer, Wagner, dan Dragendorf yang akan menimbulkan endapan warna berturut-turut putih, cokelat, dan merah jingga. Uji saponin. Sebanyak 0,1 g serbuk/ekstrak andaliman ditambahkan ke dalam 10 ml air panas dan dididihkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat dikocok dalam tabung reaksi tertutup selama 10 detik, kemudian dibiarkan selama 10 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih stabil. Uji tanin. Sebanyak 0,1 g serbuk/ekstrak andaliman ditambahkan ke dalam 10 ml air panas dan dididihkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat ditambahkan dengan 10 ml FeCl 3 1%. Uji positif ditandai munculnya warna hijau kehitaman. Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH dan ABTS Larutan sampel disiapkan dengan beberapa konsentrasi 500, 400, 300, 200, 100, 50, dan 25 ppm. Kemudian 100 μl larutan DPPH (0,0118 g dalam 100 ml etanol) (Batubara et al. 2009) dan ABTS (ABTS dalam K 2 SO 4 ) (Rohim et al. 2008) ditambahkan pada masing-masing sumur mikro untuk metode DPPH dan ABTS. Setelah diinkubasi selama 30 menit absorbansi diukur pada panjang gelombang 517 nm untuk metode DPPH dan 414 nm untuk metode ABTS. Kontrol positif yang digunakan adalah troloks dalam etanol. Persen inhibisi antioksidan metode DPPH dan metode ABTS dihitung dengan rumus berikut: % Inhibisi Absorban blanko Absorban sampel X 100% Absorbansi blanko A blanko adalah absorbansi campuran etanol dan pereaksi (DPPH dan ABTS). Setiap konsentrasi sampel dan kontrol positif (Troloks) diuji tiga kali pengulangan. Uji Aktivitas Inhibitor α-glukosidase (Suarsana et al 2008) Sampel yang diuji dilarutkan dalam pelarut dimetil sulfoksida (DMSO) dengan konsentrasi 0,26; 0,13; 0,065; 0,0325; 0,01625; dan 0,00813 % (b/v). Sebanyak 1,0 mg α-glukosidase dilarutkan dalam 1 ml bufer fosfat 100 mm (ph
15 7,0) kemudian ditambahkan 200 mg SBA yang telah dilarutkan dalam bufer fosfat 100 mm (ph 7,0). Sebelum digunakan, 1 ml larutan enzim tersebut diencerkan 25 kali dengan bufer fosfat 100 mm (ph 7,0). Campuran reaksi terdiri atas 25 µl PNG 20 mm sebagai substrat, 50 µl larutan bufer fosfat 100 mm (ph 7,0), dan 50 µl larutan sampel dalam DMSO. Campuran reaksi diinkubasi selama 15 menit dan ditambahkan 25 µl larutan α-glukosidase, kemudian diinkubasi selama 15 menit. Reaksi enzim dihentikan dengan penambahan 1000 µl Na 2 CO 3 dan p- nitrofenol yang dihasilkan dibaca absorbannya dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 400 nm. Tablet akarbosa (Glukobay) dilarutkan dalam bufer dan HCl 2N (1:1) dengan konsentrasi 6; 3; 1,5; 0,75; 0,375; 0,188; 0,094 % b/v sebagai kontrol positif. Absorbansi hasil reaksi tersebut diukur dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 400 nm. Pengukuran absorbans sampel dan kontrol positif dilakukan dengan dua kali ulangan (duplo). Data kontrol positif digunakan sebagai pembanding terhadap sampel yang diuji. Persentasi inhibisi dapat dihitung dengan rumus: % inhibisi K S K X 100% S = S1 S0 K S1 S0 % inhibisi K Keterangan: K = Absorban kontrol (DMSO) tanpa sampel (kontrol blanko/kontrol negatif) S1 = Absorban sampel dengan penambahan enzim. S0 = Absorban sampel tanpa penambahan enzim. Penentuan Eluen Terbaik Ekstrak pekat buah andaliman dilarutkan dalam pelarut asal yang sesuai dan ditotolkan pada pelat KLT. Setelah kering langsung dielusi dalam bejana yang telah dijenuhkan oleh uap eluen pengembang. Elusi pengembang dimulai dengan menggunakan pelarut tunggal (n-heksana, etilasetat, kloroform, asam asetat, etanol, metanol). kemudian dilanjutkan dengan perbandingan beberapa eluen tunggal terbaik. Noda hasil elusi diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm.
16 Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Fraksinasi adalah proses pemisahan komponen dalam suatu ekstrak menjadi kelompok-kelompok senyawa yang memiliki kemiripan karakteristik secara kimia (Rouessac dan Rouessac 2007). Kromatografi kolom dan KLTP merupakan teknik analisis dalam penentuan jumlah komponen senyawa tertentu dari campurannya. kromatografi bertujuan untuk mengetahui komponen-komponen senyawa aktif kimia yang dapat terpisah (Hayani 2007). Dalam pemisahan dengan kromatografi kolom ini, suatu pengelusi dialirkan secara terus menerus melalui kolom. Komponen-komponen (eluat) yang keluar dari kolom ditampung kedalam tabung reaksi dengan volume masing-masing sebanyak 5 ml dan digabung berdasarkan pola spot atau nilai Rf dari setiap tabung yang diuji dengan KLT untuk menentukan jumlah fraksi yang terbentuk. Untuk memperoleh senyawa yang lebih murni, selanjutnya dapat dilakukan dengan KLTP. Kromatografi lapis tipis preparatif merupakan kromatografi preparatif yang dapat digunakan untuk memurnikan komponen yang diperoleh dari pemisahan dengan kromatografi kolom. Kelebihan KLTP adalah merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sedikit baik penyerap maupun cuplikannya, kemudian dapat digunakan untuk mencari eluen terbaik untuk kromatografi kolom. Identifikasi Senyawa (harborne 1987) Identifikasi senyawa menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan IR. Spektrofotometer UV-Vis digunakan untuk mengukur spektrum serapan senyawa dalam sampel pada panjang gelombang 200 400 nm. Identifikasi dengan menggunakan IR dilakukan dengan cara menghaluskan sampel bersamaan dengan serbuk KBr dalam mortar agat. Setelah dihaluskan dan bercampur, kemudian serbuk ini dimasukkan ke dalam alat pencetak pelat KBr, sehingga diperoleh serbuk lempeng yang transparan. Lempeng yang diperoleh dimasukkan kedalam spektrofotometer IR untuk dilakukan analisis spektrum FTIR.
17 HASIL DAN PEMBAHASAN Persiapan dan Ekstraksi Sampel Sebanyak 5 kg buah segar tanaman andaliman asal Medan diperoleh dari Pasar Senen, Jakarta. Hasil identifikasi yang dilakukan oleh Pusat Penelitian Biologi LIPI, Bogor, menunjukkan buah tanaman andaliman yang digunakan dalam penelitian ini termasuk dalam jenis Zanthoxylum acanthopodium DC, suku Rutaceae (Lampiran 2). Secara berturut-turut besarnya kadar air, dan kadar abu buah andaliman adalah 9,59 % dan 28,42 %. Berdasarkan hasil ekstraksi dengan menggunakan pelarut n-heksana etilasetat, metanol, dan air diperoleh ekstrak pekat dengan urutan nilai rendemen masing-masing sebesar 1,79 %; 2,57 % ;4,22 %; dan 4,90 % (Lampiran 3). Dari nilai rendemen yang diperoleh menunjukkan, pelarut air dapat mengekstraksi komponen lebih banyak dibanding pelarut yang lain, hal ini dimungkinkan karena pelarut air bersifat lebih polar, sehingga semua komponen yang belum terekstrak oleh pelarut n-heksana, etilasetat, dan metanol akan terekstraksi oleh air. Uji Aktivitas dan Pemilihan Ekstrak Terbaik Buah Andaliman Parameter utama yang digunakan dalam pemilihan ekstrak terbaik adalah nilai IC 50 dari hasil uji aktivitas antioksidan, dan inhibitor enzim α-glukosidase. Uji fitokimia merupakan uji kualitatif yang digunakan untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder dalam suatu sampel (bahan). Uji ini dilakukan terhadap serbuk kering, ekstrak kasar, dan fraksi dari hasil proses fraksinasi buah andaliman. Dari hasil uji aktivitas, diperoleh ekstrak metanol memiliki aktivitas yang paling baik sebagai antioksidan dan inhibitor α- glukosidase, karena memiliki IC 50 yang lebih rendah dibanding ekstrak yang lain (Tabel 2). Hasil uji fitokimia memperlihatkan, bahwa senyawa aktif yang memiliki aktivitas paling tinggi seperti yang terdapat di dalam ekstrak metanol adalah senyawa flavonoid, hal ini ditunjukkan dengan warna merah yang lebih tajam pada lapisan amil alkoholnya (Tabel 1).
18 Tabel 1 Hasil uji fitokimia ekstrak kasar buah andaliman Senyawa Ekstrak n-heksana etilasetat metanol air Flavonoid + ++ +++ ++ Saponin + + + Tanin + + + Alkaloid + + + ++ terpenoid + + + + Steroid + + + + Keterangan: + : mengandung komponen : tidak mengandung komponen Hal ini juga berarti bahwa ekstrak metanol didominasi oleh senyawa flavonoid. Namun, nilai rendemen, dan total fenol ekstrak metanol lebih rendah dibanding ekstrak air, berarti bahwa nilai rendemen dan nilai total fenol tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap aktivitas suatu bahan. Tabel 2 Uji total fenol, dan IC 50 aktivitas ekstrak kasar andaliman Ekstrak Rendemen (%) Total fenol (mg asam galat/100 g ekstrak) IC 50 (ppm) DPPH ABTS Inhibitor α- glukosidase n-heksana 1,79 38,75 Etilasetat 2,57 184,91 895,04 52,83 5574 Metanol 4,22 375,54 390,92 30,04 323 Air 4,90 460,91 71,61 Kontrol positif Troloks 10,17 25,67 Akarbosa 0,54 Tanda ( ): Tidak aktif: IC 50 melebihi konsentrasi maksimum sampel: antioksidan (800 ppm), inhibitor α-glukosidase (10.000 ppm)
19 Rendemen adalah persentasi bobot produk akhir dibandingkan terhadap bobot awal, dalam hal ini rendemen merupakan kadar komponen yang terekstraksi (terbawa oleh pelarut) sesuai dengan tingkat kepolaran di dalam serbuk buah andaliman yang dinyatakan dengan persen. Total fenol adalah banyaknya senyawa fenolik yang terdapat dalam suatu ekstrak. Senyawa-senyawa fenolik memiliki aktivitas antioksidan karena kemampuannya mendonorkan atom hidrogen dari gugus hidroksilnya kepada senyawa radikal. Senyawa fenol tumbuhan dapat menimbulkan gangguan besar karena kemampuannya membentuk kompleks dengan protein dengan cepat sekali melalui ikatan hidrogen (Harborne 1987). Senyawa fenol terbagi atas 3 kelompok, yaitu (1). golongan fenol sederhana (Vanilin, gingerol, shogaol, gualakol, dan eugenol); (2). Asam fenol (p-kresol, 3-etilfenol, hidrokuinon, dan asam galat); dan (3) flavonoid (antosianin, flavonon, flavonol dan tanin) (Parhusip 2006). Berdasarkan nilai total fenol dan rendemen serta nilai IC 50 dapat disimpulkan, ekstrak air yang memiliki rendemen dan total fenol yang lebih tinggi, tetapi aktivitasnya lebih rendah dibanding dengan ekstrak metanol. Hal ini disebabkan karena ekstrak metanol lebih banyak mengandung senyawa flavonoid yang aktif sebagai antioksidan dan inhibitor enzim α-glukosidase. Pencarian Eluen Terbaik Berdasarkan analisis KLT dengan eluen tunggal, kloroform dan metanol menunjukkan keterpisahan yang bagus, hal ini berdasarkan keterpisahan dan jumlah spot yang terbentuk lebih banyak (Gambar 6). Untuk mengetahui keterpisahannya, dilakukan analisis pencarian eluen KLT dengan menggunakan perbandingan antara kloroform dan metanol pada 1:1; 2:1; 3:1; 6:1; dan 9:1. Dari hasil analisis yang diperoleh menggunakan KLT GF 254, menunjukkan bahwa kloroform dan metanol dengan nisbah (9:1) dan (2:1) memberikan hasil yang baik, yaitu jumlah spot paling banyak dan pola spot yang baik. Namun, berdasarkan keterpisahan (jarak) antara spot yang satu dengan yang lainnya, perbandingan (9:1) lebih baik dibanding (2:1), karena jarak spot hampir sama dengan spot yang lain seperti terlihat pada Gambar 7.
20 Gambar 6 Profil spot pencarian eluen terbaik dengan pelarut tunggal dari kiri ke kanan: n-heksana, diklorometana, klorofom, etilasetat, aseton, etanol dan metanol. Noda pemisahan dideteksi di bawah lampu UV 254 dan 366 nm. Eluen terbaik yang diperoleh selanjutnya akan digunakan untuk analisis KLT fraksi hasil dari fraksinasi dengan kromatografi kolom. Gambar 7 Profil spot pencarian eluen terbaik dengan perbandingan kloroformmetanol, dengan urutan perbandingan dari kiri ke kanan (1:1); (2:1); (3:1); (6:1); dan (9:1). Fraksinasi Ekstrak Teraktif Fraksinasi dilakukan terhadap ekstrak metanol sebagai ekstrak yang paling aktif. Pemisahan dilakukan dalam kolom dengan metode step gradient (peningkatan kepolaran), hal ini bertujuan untuk mempercepat pemisahan semua komponen yang terkandung dalam ekstrak. Sebanyak 8,61 g ekstrak metanol
21 dimasukkan secara perlahan ke dalam kolom untuk 4 kali ulangan. Elusi dimulai dengan pelarut n-heksana, kemudian dilanjutkan dengan perbandingan n-heksan dan etilasetat pada perbandingan 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 dan etilasetat 100%, dengan cara yang sama dilanjutkan dengan perbandingan etilasetat dan metanol dan diakhiri perbandingan metanol dan air. Hasil pemisahan ekstrak ditampung sebanyak 5.0 ml dalam setiap tabung reaksi dan dimonitor melalui kromatografi lapis tipis (KLT) dengan menggunakan eluen terbaik yang dicari sebelumnya (klorofom-metanol = 9:1). Berdasarkan pemisahan yang dilakukan diperoleh 358 tabung. (A) (B) (C) (D) (E) (F) Gambar 8 Profil KLT 6 fraksi (A-F) hasil fraksinasi kromatografi kolom dengan eluen step gradien. Penggabungan dilakukan berdasarkan nilai Rf pada KLT dan kesamaan pola spot dari setiap tabung (Lampiran 6), dari hasil penggabungan diperoleh enam fraksi (A-F). Kemudian setelah semua fraksi (A-F) diuapkan hingga pekat diperoleh urutan nilai rendemen masing-masing sebesar 6,15; 12,27; 5,49; 27,04; 7,47; dan 10.21 % (b/b) (Lampiran 7). Pemilihan fraksi terbaik hasil fraksinasi dengan kromatografi kolom Berdasarkan uji aktivitas, fraksi C dan E memiliki aktivitas paling baik sebagai inhibitor α-glukosidase dan antioksidan. Pemilihan fraksi terbaik berdasarkan
22 nilai IC 50 (Tabel 3). Semakin kecil nilai IC 50, aktivitasnya semakin baik. Dari hasil uji fitokimia flavonoid (Tabel 4), menunjukkan fraksi C dan E memiliki warna jingga yang lebih tajam pada lapisan amil alkoholnya. Hal ini menunjukkan, bahwa fraksi C dan E didominasi oleh senyawa flavonoid, sehingga dapat disimplukan, bahwa senyawa utama yang berpotensi sebagai antioksidan maupun sebagai inhibitor α-glukosidase seperti yang terdapat fraksi C dan E adalah senyawa flavonoid, tentu hal ini pengaruh dari peranan atom hidrogen. Tabel 3 Data IC 50 aktivitas fraksi hasil fraksinasi dengan kromatografi kolom IC 50 (ppm) Fraksi Rendemen (%) DPPH ABTS Inhibitor α- glukosidase A 6,13 81,00 B 12,27 527,32 117,00 C 5,49 720,39 498,86 16,00 D 27,04 601,17 710,64 39,00 E 7,47 444,77 181,79 27,00 F 10,21 1687,88 906,58 Kontrol positif Troloks 10,17 25,67 Akarbosa 0,54 Keterangan: ( ): IC 50 melebihi konsentrasi maksimum: 800 ppm untuk antioksidan 2600 ppm untuk inhibitor α-glukosidase. Atom hidrogen pada gugus hidroksil senyawa flavonoid dapat disumbangkan untuk kestabilan radikal bebas, dan atom hidrogen juga dengan cepat sekali mampu membentuk kompleks dengan protein pada enzim melalui ikatan hideogen, akibatnya, sering terjadi hambatan terhadap kerja suatu enzim. Berdasarkan uji fitokimia, fraksi D yang memiliki rendemen terbanyak lebih didominasi oleh senyawa alkaloid dan terpenoid yang ditunjukkan dengan adanya endapan berwarna coklat pekat saat penambahan pereaksi Wagner dan warna hijau setelah penambahan pereaksi Lieberman-Buchard.
23 Tabel 4 Uji fitokimia dan IC 50 aktivitas ekstrak fraksi hasil kromatografi kolom Parameter Fraksi A B C D E F Flavonoid + ++ +++ ++ +++ ++ Saponin Tanin Alkaloid ++ + + +++ + + Steroid + ++ Terpenoid + + ++ +++ Keterangan: ( ): tidak terdeteksi Fraksinasi Fraksi Terbaik Dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Fraksi C dan E merupakan fraksi teraktif sebagai inhibitor α-glukosidase dan antioksidan lebih lanjut dimurnikan dengan KLTP. Pemisahan dengan KLTP menggunakan perbandingan pelarut kloroform : metanol (9:1) untuk fraksi C dan klorofom-metanol-heksana (3:1:1) untuk fraksi E sebagai eluen terbaiknya yang sudah dicari sebelumnya. Alasan perbedaan eluen terbaik yang digunakan adalah karena fraksi E memiliki satu spot pada saat dimonitor dengan pelat KLT sehingga diduga adanya penumpukan senyawa. (A) (B) Gambar 9 Profil pola spot fraksi hasil KLTP fraksi C dan E berturut-turut dari kiri ke kanan fraksi (a). FC 1 - FC 10 dan (b). FE 1 - FE 8 (Visualisasi spot: UV 254 nm)
24 Pemisahan ini menggunakan adsorben silika gel. Berdasarkan pemisahan yang dilakukan, untuk fraksi C diperoleh 10 fraksi (FC1-FC10) dan untuk fraksi E diperoleh 8 fraksi (FE1-FE2). Spot yang terbentuk dideteksi dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Nilai Rf ke-10 fraksi dari fraksi E (C1-C10) dan 8 fraksi dari fraksi E (E1-E2) dapat dilihat pada Lampiran 9. Pemilihan Fraksi Terbaik Hasil Fraksinasi Dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Dari hasil uji aktivitas terhadap fraksi hasil fraksinasi dengan KLTP menunjukkan bahwa Fraksi C2 dan E2 adalah fraksi yang memberikan sifat inhibisi yang paling baik sebagai inhibitor α-glukosidase dan antioksidan, karena kedua fraksi memiliki nilai IC 50 yang lebih rendah (Tabel 5). Tabel 5 Nilai IC 50 aktivitas untuk fraksi hasil fraksinasi dengan kromatograpi lapis tipis preparatif (KLTP) Fraksi C Rendemen (%) IC 50 (ppm) Inhibitor α-glukosidase Fraksi E Rendemen (%) IC 50 (ppm) DPPH ABTS C1 5,44 80,65 E1 22,09 386,61 168,26 C2 6,31 34,72 E2 7,44 137,46 74,02 C3 2,32 E3 4,04 126,95 C4 7,47 E4 2,71 249,82 C5 4,63 E5 1,61 338,44 C6 3,99 E6 0,94 309,93 C7 3,59 E7 1,69 C8 2,12 E8 1,38 C9 0,39 C10 2,32 Kontrol positif Akarbosa 0,54 Troloks 10,17 25,67 Keterangan: ( ): Tidak aktif
25 Secara keseluruhan nilai IC 50 Ekstrak kasar dan fraksi buah andaliman lebih besar dibanding kontrol positif, berarti aktivitas kontrol positif masih lebih baik bila dibandingkan dengan ekstrak kasar dan fraksi buah andaliman. Hal ini dimungkinkan senyawa yang terdapat dalam sampel belum murni seperti halnya troloks dan akarbosa. Apabila hasil ini dibandingkan dengan tumbuhan lain seperti ekstrak etanol 70% daun sirih merah (IC 50 = 85,82 ppm) dengan metode DPPH (Alfarabi 2010), buah andaliman memiliki nilai IC 50 yang lebih besar, Berarti aktivitas antioksidan daun sirih merah lebih tinggi dari pada buah andaliman, namun untuk aktivitas inhibitor α-glukosidase, berdasarkan nilai IC 50 ekstrak metanol, fraksi C dan fraksi C2 buah andaliman masing-masing sebesar: 322 ppm; 16 ppm; dan 34,72 ppm, tentu hasil ini menunjukkan bahwa aktivitas inhibitor α-glukosidase ekstrak buah andaliman jauh lebih tinggi dibanding daun sirih merah yang memiliki inhibisi terbesar 39,62 % pada konsentrasi 1 % (10.000 ppm) dan inhibisi terkecil sebesar 1,26 % pada konsentrasi 0,1 % (1000 ppm). Identifikasi dan Pendugaan Senyawa Aktif Pendugaan senyawa aktif utama yang berpotensi sebagai antioksidan dan inhibitor α-glukosidase pada fraksi C2 dan E2 dilakukan berdasarkan data yang diperoleh dari hasil identifikasi dengan menggunakan spektrofotometer IR dan data panjang gelombang maksimum dari hasil identifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis. Berdasarkan hasil analisis dengan Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) (Gambar 9) memperlihatkan masing-masing fraksi C2 dan E2 memiliki gugus fungsi OH, C=O, C-O, dan C-H alifatik, serta C-H aromatik. Gugus-gugus fungsi ini merupakan gugus fungsi yang khas atau yang umum ditemukan pada senyawa flavonoid, sehingga diduga senyawa aktif utama yang terdapat pada fraksi C2 dan E2 adalah senyawa flavonoid.