BAB 3 METODOLOGI PERCOBAAN 3.1 Alat-Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Beaker glass 50 ml pyrex Beaker glass 100 ml pyrex Beaker glass 150 ml pyrex Beaker glass 200 ml pyrex Erlenmeyer 50 ml pyrex Erlenmeyer 100 ml pyrex Erlenmeyer 150 ml pyrex Erlenmeyer 250 ml pyrex Erlenmeyer 500 ml pyrex Erlenmeyer 1000 ml pyrex Satu set alat refluks Cawan petri Corong kaca Spatula
Magnetic stirrer otplate Oven ika ret basic Memmert Pipet tetes Indikator p-fix 0-14 Thermometer 100 0 c Silber Brand AAS FT-IR Bruker 3.2 Bahan-bahan Neraca Analitik Serbuk cangkang kepiting NaO 3,5 % NaO 50 % Cl 1 M C 3 COO 10 % Larutan ninhidrin KBr Aquadest Kertas saring whatman
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Pembuatan reagen 3.3.1.1 Pembuatan Cl 1 M Diukur Cl pekat 37 % sebanyak 83 ml dan diencerkan dengan aquadest dalam labu 1000 ml hingga garis tanda. 3.3.1.2 Pembuatan NaO 3,5 % Ditimbang NaO pellet sebanyak 3,5 g dan dilarutkan dengan aquadest dalam labu takar 100 ml hingga garis tanda. 3.3.1.3 Pembuatan larutan NaO 50 % Ditimbang NaO pellet sebanyak 50 g dan dilarutkan dengan aquadest dalam labu takar 100 ml hingga garis tanda. 3.3.1.4 Pembuatan C 3 COO 10 % Diukur 10 ml C3COO 100 % dan diencerkan dengan aquadest dalam labu takar 100 ml sampai garis tanda.
3.3.2 Tahap isolasi kitin Cangkang kepiting dikeringkan dan dihaluskan kemudian diayak.dalam isolasi kitin terdiri dari 2 tahap, yaitu demineralisasi dan proteinasi. 3.3.2.1 Tahap Demineralisasi Sebanyak 20 g cangkang kepiting dimasukkan kedalam beaker glass di tambahkan 520 ml asam klorida (Cl) 1 M dengan perbandingan 1:26. kemudian disaring dengan kertas saring whatman, dicuci dengan aquadest sampai p netral dan dikeringkan pada suhu kamar. 3.3.2.2 Tahap Deproteinasi Sebanyak 3 g padatan dari hasil demineralisasi di masukkan dalam bejana tahan asam dan tahan basa di lengkapi dengan pengaduk magnetik stirrer, pengangas minyak dan termometer, di tambahkan30 ml natrium hidroksida (NaO) 3,5% dengan perbandingan 1:10 dan di refluks selama 30 menit pada suhu 60 o C. kemudian disaring dengan kertas saring whatman sampai p netral dan dikeringkan dalam oven pada suhu 60 o c selama 4 jam. 3.3.3 Tahap Deasetilasi Sebanyak 1 g kitin di masukkan dalam bejana tahan asam dan tahan basa di lengkapi dengan pengaduk magnetic stirrer, pengangas minyak dan termometer, ditambahkan 10 ml natrium hidroksida (NaO) 50% dengan perbandingn 1:1,
direfluks selama 30 menit pada suhu 100 o c. disaring padatan dan dicucui sampai p netral. kitosan basa yang dihasilkan dikeringkan dalam oven pada suhu 60 o c selama 4 jam. 3.3.4 Tahap Analisa 3.3.4.1 Uji Mineral Pada cangkang kepiting terdapat berbagai jenis mineral, tahap demineralisasi dilakukan bertujuan untuk membuang mineral yang terdapat dalam cangkang kepiting, dan alat yang digunakan adalah AAS. 3.3.4.2 Uji Protein Sebanyak 1 g protein didestruksi dengan 9 g asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga dihasilkan ammonium sulfat. Setelah ditambahkan dengan alkali kuat, ammonium yang terbentuk didestilasi uap secara kuantitatif kedalam larutan penyerap dan selanjutnya ditetapkan secara titrasi. 3.3.4.3 Uji Kadar Kadar Air Sebanyak 0,5 g dalamcawan porselin atau gelas arloji yang telahdiketahui beratnya. Sampel dipanaskan dalam ovenpada suhu 10005 o C selama 1-2 jam (tergantungbahannya). Kemudian didinginkan dalam desikatorselama kurang lebih 30 menit dan ditimbang.dipanaskan lagi dalam oven, lalu didinginkan
dalam desikator dan diulangi hingga berat konstan. Perhitungan kadar air dapat dilakukan dengan rumus sebagai berikut (Sudarmaji, 1994): % kadar air = aa bb aa 100% Keterangan: a : Berat kitosan awal (g) b : Berat kitosan setelah di oven (g) 3.3.4.4 Uji Kelarutan Seberat 0,5 g masing masing kitin dan kitosan dimasukkan kedalam beaker glass, ditambahkan dengan 10 ml C 3 COO dan diaduk dengan magnetik stirrer selama 20 menit. diamati perubahan yang terjadi, kelarutan diamati dengan membandingkan kejernihan larutan kitosan dengan kejernihan pelarutnya. 3.3.4.5 Uji Ninhidrin Seberat 0,1 g kitosan yang diperoleh daripenelitian ditempatkan dalam suatu wadah dandisemprotkan dengan larutan ninhidrin kemudiandidiamkan selama 5 menit, diamati perubahanyang terjadi. 3.3.4.6 Penentuan Derajat Deastilasi Kitosan Untuk mengetahui derajat deasetilasinya (DD) digunakan metode base line yang diusulkan oleh Domszy dan Rovert (Khan etal., 2002).Penentuan derajat deasetilasi kitosan digunakan metode infra merah. Cuplikan dibuat pellet dengan 1 % KBr (Kaban., 2007).
Nilai absorbansi dapat dihitung dengan menggunakan rumus: A = log (P 0 /P) P P 0 : % transmitasi pada garis dasar : % transmitasi pada puncak minimum Perbandingan antara absorbansi pada A= 1.655 cm ( serapan pita amida 1) dengan absorbansi pada A= 3450 cm ( serapan gugus hidroksil ) dihitung. Untuk N-deasetilasi kitin yang sempurna (100%) diperoleh nilai A 1655 = 1,33. Pengukuran nilai absorbansi pada puncak yang terkait, derajat N- deasetilasi dapat dihitung dengan cara: %N Deasetilasi = 1 AA1655 AA3450 xx 1,33 x 100 % A1655 : Absorbansi pada panjang gelombang amida/asetamida 1588cm - untuk serapan gugus A3450 : Absorbansi pada panjang gelombang hidroksil (O) 3410cm - untuk serapan gugus 3.3.4.7 Analisa Gugus fungsi pada FT-IR Spektrofotometer FT-IR digunakan untuk merekam spektra FTIR kitosan untuk menentukan struktur kimia. Cuplikan padat berbentuk butiran diukur spektranya dengan cara dibuat dalam bentuk pellet KBr. idupkan UVS dan FT-IR, hidupkan
komputer, buka opus 65, bersihkan tempat dan letakan sampel, masukkan sampel, dilihat hasil pada monitor. 3.4 Bagan Penelitian 3.4.1 Tahap Demineralisasi 20 g Cangkang Kepiting dimasukkan kedalam beaker glass ditambahkan 520 ml asam klorida (Cl) 1M dengan perbandingan 1:26 disaring dengan kertas whatman filtrat residu dicuci dengan aquadest diukur p sampai p netral dikeringkan pada suhu ruangan hasil ditimbang padatan
3.4.2 Tahap Deproteinasi 3 g Padatan dari asil Demineralisasi dimasukkan dalam bejana tahan asam dan tahan basa di lengkapi dengan pengaduk magnetik stirrer, pengangas minyak dan termometer ditambahkan 30 ml natrium hidroksida (NaO) 3,5% dengan perbandingan 1:10 direfluks selama 30 menit pada suhu 60 o C didinginkan disaring padatan dengan kertas saring whatman ` filtrat residu dicuci dengan aquadest diukur p sampai p netral dikeringkan dalam oven pada suhu 60 0 C ditimbang asil
3.4.3 Tahap Deasetilasi 1 g dari asil Demineralisasi ditimbang 1 g kitin dimasukkan dalam bejana tahan asam dan tahan basa di lengkapi dengan pengaduk magnetic stirrer, pengangas minyak dan termometer ditambahkan 10 ml natrium hidroksida (NaO) 50% dengan perbandingn 1:1 di refluks selama 30 menit pada suhu 100 o c didinginkan disaring padatan kertas saring whatman filtrat residu dicuci dengan aquadest diukur p sampai p netral dikeringkan dalam oven pada suhu 60 0 C
ditimbang hasil BAB 4 ASIL DAN PEMBAASAN 4.1 asil 4.1.1 Analisa FTIR 4.1.1.1 Cangkang Kepiting Dari data spektroskopi FT-IR cangkang kepiting memberikan spektrum dengan puncak puncak vibrasi pada daerah bilangan gelombang 3451,63 cm ; 2924,92 cm ; 1640,01 cm ; 1415,70 cm ; 1154,63 cm ; 1072,20 cm ; 1027,97 cm ; 873,41 cm (Gambar 4.1 )
Gambar 4.1. Spektrum FT-IR senyawa cangkang kepiting 4.1.1.2 Kitin Dari data spektroskopi FT-IR kitin yang dihasilkan dari proses deproteinasi memberikan spektrum dengan puncak-puncak vibrasi pada daerah bilangan gelombang 3448,07 cm ; 2891,40 cm ; 2361,25 cm ; 1637,66 cm ; 1382,31 cm ; 1315,57 cm ; 1074,17 cm (Gambar 4.2).
3448.07 2961.31 2931.80 2891.40 2361.25 2342.80 1637.66 1419.32 1382.31 1315.57 1261.49 1204.82 1156.95 1115.93 1074.17 1025.25 953.06 895.56 752.14 669.13 637.76 Transmittance [%] 30 40 50 60 70 80 90 100 3500 3000 2500 2000 Wavenumber cm 1500 1000 Gambar 4.2 Spektrum FT-IR senyawa kitin 4.1.1.3 Kitosan Derajat deasetilasi yang dihasilkan kitosan adalah 99.006 %. Dari data spektroskopi FT-IR kitosan memberikan spektrum dengan puncak-puncak vibrasi pada daerah bilangan gelombang 3449,38 cm ; 2891,23 cm ; 1627,40 cm ; 1379,85 cm ; 1315,33 cm ; 1075,30 cm 1 (Gambar 4.3)
Gambar 4.3 Spektrum FT-IR senyawa kitosan Tabel 4.1 Perbandingan kemunculan bilangan gelombang pada cangkang kepiting,kitin dan kitosan Gugus Fungsi Bilangan Gelombang (cm ) Cangkang Kepiting Kitin Kitosan -O 3451,63 cm 3448,07 cm 3449,38 cm -N2 3451,63 cm 3448,07 cm 3449,38 cm -C-O-C- 1072,20 cm 1074,17 cm 1075,30 cm -C=O 1640,01 cm 1637,66 cm 1627,40 cm -C- 2924,92 cm 2891,40 cm 2891,23 cm -N-C- - 1315,57 cm 1315,33 cm -C3-1382,31 cm 1379,85 cm
Cangkang kepiting Kitosan Kitin Gambar 4.4Perbandingan kemunculan bilangan gelombang pada cangkang kepiting, kitin dan kitosan
4.1.2 asil Uji Mineral Tabel 4.2 asil Uji Mineral asil Uji Cangkang Parameter Satuan Kepiting Demineralisasi Metode Uji Ca Ppm 5,22 < 0,001 AAS Mg % 1,01 0,003 AAS Na % 15,98 0,08 AAS Zn Ppm 14,54 9,28 AAS Cu Ppm 3,04 2,42 AAS Fe Ppm 38,78 256,55 AAS LoD Ca= 0,001 ppm 4.1.3 asil Uji Protein Tabel 4.3 asil Uji Protein Sampel asil Uji Metode UJi Cangkang Kepiting 13,08 % SNI 01.0008.1987 asil Demineralisasi 43,33% SNI 01.0008.1987 Kitin 39,61 % SNI 01.0008.1987
4.1.4 asil Uji Kadar Air % kadar air = 0,5 0,4662 0,5 100% = 6,76% Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan kadar air yang di peroleh dari kitosan adalah 6, 76 %. 4.1.5 Rendemen Cangkang Kepiting Laut Menjadi Kitosan Dari 20 g cangkang kepiting pada tahap demineralisasi diperoleh hasil 5,0739 gr. 3 gr dari hasil demineralisasi pada tahap deproteinasi diperoleh hasil 1,8335 gr. Rendemen % = jjjjjjjjjj h haaaaaaaa yyyyyyyy dddddddddddddddd h jumlah bahan sebelum diolah * Rendemen % = 5,0739 20 * Rendemen % = 1,8335 3 * Rendemen % = 0,9084 1 x 100 % =25,4695 % xx 100 % = 61,1166 % xx 100 % = 90,84 % 4.1.6 asil Uji Kelarutan Kelarutan kitosan dan kitin dalam asam asetat 10 %. % kelarutan = jumlah hasil yang di peroleh jjjjjjjjjj h bbbb haaaa ssssssssssssss dddd oooooo h xx 100 %, % kelarutan kitosan = 0,0615 0,5 xx 100 % = 12,3 %, % kelarutan kitin = 0,0085 0,5 xx 100 % = 0,17 %
4.1.7 asil Uji Ninhidrin asil positif ditunjukkan dengan perubahan warna dari putih krem menjadi ungu.kitosan yang direaksikan berubah warna menjadi violet sedangkan pada kitin tidak. 4.1.8 Derajat Deasetilasi Derajat deasetilasi adalah prersentasi gugus asetil yang berhasil dihilangkan selama proses deproteinasi kitin, dimana kitin diberi perlakuan dengan menambahkan NaO 50 % yang menyebabkan terhidrolisisnya gugus asetil dari gugus asetamida pada kitin. Derajat deasetilasi dapat ditentukan dari spektrum serapan spektroskopi IR dengan metode garis dasar.puncak tertinggi dicatat dan diukur dari garis dasar yang dipilih. Perbandingan dari bilangan antara serapan pita amida ( 1655 cm ) dengan serapan pita hidroksil (3450 cm ). % N Deasetilasi = = 1 A1655 AA3450 xx 1,33 x 100 % % DD = = 1 3,02233 228,572 xx 1,33 x 100 % % DD = 99,006 4.2 Pembahasan 4.2.1 Analisa FT-IR Spektroskopi FT-IR mencatat penyerapan energi sebagai fungsi dari frekuensi yang menurun dari kiri ke kanan. Energi getaran rentang untuk molekul-molekul organik bersesuaian dengan radiasi infra merah dengan bilangan gelombang antara 1200 4000 cm.bagian tersebut dari infra merah berguna untuk mendeteksi adanya gugus fungsi senyawa organik (Pine, dkk, 1988 ).
O O 2 C O O N C O C 3 O O 2 C O O N O C O C 3 + NaO n Kitin O O 2 C O O O O N 2 Kitosan 2 C O N 2 O + C 3 COONa n Gambar 4.4 Transformasi Kitin Menjadi Kitosan Dari Gambar 4.4 dapat kita lihat bagaimana transformasi kitin menjadi kitosan dimana setelah penambahan NaO 50 % terjadi pemutusan gugus asetil dengan atom nitrogen yang terdapat pada kitin sehingga menghasilkan suatu amina, untuk mengetahui struktur yang terdapat pada cangkang kepiting, kitin dan kitosan digunakan analisa FT-IR. Pada tabel 4.1 dapat dilihat bahwa pada cangkang kepiting tidak terdapat C N dan C 3. Analisa FT-IR juga bertujuan untuk mengetahui derajat deasetilasi absorbansi pada panjang gelombang 1588 cm - untuk serapan gugus amida/asetamida absorbansi pada panjang gelombang 3410 cm - untuk serapan gugus hidroksil (O) sehingga didapat derajat deasetilasi sebesar 99,006 %.
4.2.2 Analisa Protein dan Mineral Pada Cangkang Kepiting Sebelum dan Sesudah Demineralisasi dan Kitin Protein umumnya tersusun dari 20 macam asam amino, dimana asam amino umumnya mempunyai satu gugus karboksilat dan satu gugus amina ( Riswiyanto S. 2009). Kitin pada umumnya terikat dengan protein, mineral dan berbagai macam pigmen (Sugita, dkk, 2009).Pada cangkang kepiting juga masih terkandung mineral dan protein. Pada penelitian ini dilakukan analisa mineral dan protein untuk mengetahui perbandingan kadar protein pada cangkang kepiting yang belum diberi perlakuan, setelah didemieralisasi dan setelah dideproteinasi. Analisa protein dengan metode kjeldahl dengan perbandingan cangkang kepiting, hasil demineralisasi dan kitin dari hasil deproteinasi secara berurutan adalah 13,08 %, 43,33 %, dan 39,61 %. Pada tahap demineralisasi terjadi peningkatan kadar protein karena sudah melalui tahap demineralisasi yang bertujuan untuk menghilangkan kadar mineral yang terdapat pada cangkang kepiting sehingga sebagian besar yang tertinggal adalah protein. Pada proses deproteinasi terjadi penurunan kadar protein karena tujuan dari deproteinasi adalah menghilangkan protein yang akan terikat secara kovalen dengan kitin, akan terlepas dan membentuk natrium proteinat. Sedangkan pada analisa mineral dilakukan untuk pengetahui perbandingan kadar mineral pada cangkang kepiting dan hasil demineralisasi. Analisa mineral dari cangkang kepiting sebelum dan sesudah demineralisasi dari Kepiting dan hasil dari demineralisasi adalah Ca (5,22 % : < 0,001 ppm), Mg (1,01 % : 0,003 %), Na (15,98 % : 0,08 %), Zn (14,54 ppm : 9,28 ppm), Cu (3,04 ppm : 2,42 ppm), Fe (256,55 ppm : 38,78 ppm). Kadar logam yang dianalisa mengalami penurunan karena sudah melalui tahap demineralisasi. 4.2.3 Karakterisasi Kitin dan Kitosan Kitosan yang di peroleh di karakterisasi untuk mengetahui mutu kitosan yang diperoleh. Karakterisasi yang dilakukan adalah uji kadar air, kelarutan dalam asetat 10 %, uji ninhidrin dan tekstur warna. asil karakterisasi pada penentuan kadar air diperoleh sebesar 6,76 % sesuai dengan standar internasional yaitu < 10
%. Pada hasil kelarutan antara kitosan dan kitin adalah 12,3 % dan 0,17% semakin tinggi kelarutan semakin bagus kualitas kitosan yang diperoleh. Ninhidrin merupakan hidrat dari triketon siklik dan jika bereaksi dengan asam amino akan menghasilkan warna violet, Pada uji ninhidrin dalam waktu 5 menit menunjukkan perubahan warna menjadi violet (art., 1983), pada penelitian ini dilakukan perbandingan antara kitosan dan kitin, dalam waktu 5 menit kitosan menunjukkan hasil berwarna violet sedangkan pada kitin tidak.namun semakin lama berubah menjadi violet hal ini terjadi karena pada kitin ada terdapat gugus amina.
BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan 1. Perbandingan kadar protein pada cangkang kepiting sebelum dan sesudah demineralisasi dan kitin secara berurutan adalah 13,08 %, 43,33 %, dan 39,61 %. 2. Perbandingan kadar mineral antara cangkang kepiting sebelum dan sesudah demineralisasi secara berurutan pada Ca (5,22 % : < 0,001 ppm), Mg (1,01 % : 0,003 %), Na (15,98 % : 0,08 %), Zn (14,54 ppm : 9,28 ppm), Cu (3,04 ppm : 2,42 ppm), Fe (256,55 ppm : 38,78 ppm). 3. Dari data spektroskopi FT-IR cangkang kepiting memberikan spektrum dengan puncak puncak vibrasi pada daerah bilangan gelombang 3451,63 cm ; 2924,92 cm ; 1640,01 cm ; 1415,70 cm ; 1154,63 cm ; 1072,20 cm ; 1027,97 cm ; 873,41 cm. Pada kitin yang dihasilkan dari proses deproteinasi memberikan spektrum dengan puncak-puncak vibrasi pada daerah bilangan gelombang 3448,07 cm ; 2891,40 cm ; 2361,25 cm ; 1637,66 cm ; 1382,31 cm ; 1315,57 cm ; 1074,17 cm. Derajat deasetilasi yang dihasilkan kitosan adalah 99.006 %. Dari data spektroskopi FT-IR kitosan memberikan spektrum dengan puncak-puncak vibrasi pada daerah bilangan gelombang 3449,38 cm ; 2891,23 cm ; 1627,40 cm ; 1379,85 cm ; 1315,33 cm ; 1075,30 cm 1
5.2 Saran Sebaiknya pada tahap demineralisasi dari cangkang kepiting dilakukan variasi konsentrasi Cl, pada tahap deproteinasi dan deasetilasi dilakukan variasi konsentrasi NaO untuk menentukan kondisi optimum dalam perubahan cangkang kepiting menjadi kitin dan kitosan.