MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Nutrisi Ternak Perah, Departemen Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Penelitian ini dilaksanakan mulai Juli 2011 sampai dengan Februari 2012. Materi Alat Alat- alat yang digunakan pada penelitian ini adalah gelas ukur, Erlenmeyer, tabung reaksi, tutup karet, isolasi panfix, hot plate, plastik tahan panas, autoclave, pipet mikro, tabung CO 2, kulkas, freezer, bunsen, spoit, magnetic stirer, pipet mohr, pipet volumetrik, sprayer, bulb, ph meter, timbangan digital, shaker water bath, vortex, tabung fermentor, tutup karet, cawan porselin, cawan conway, labu destilasi, press cooker, oven 60 o C, oven 105 o C, tanur listrik 600 o C, buret, vacum, dan alumunium foil. Bahan Hijauan pakan yang digunakan sebagai perlakuan uji kecernaan fermentatif bakteri pada penelitian ini yaitu Pennisetum purpureum, Panicum maximum, Paspalum notatum, Setaria splendida, Brachiaria humidicola. Sumber inokulum yang digunakan yaitu campuran enam isolat bakteri (A27, I8, A9, A3, B61, B6) rumen kerbau yang biasa mengkonsumsi hijauan lokal dengan kualitas nutrisi rendah dan berserat kasar tinggi di Jonggol, Bogor, Jawa Barat. Isolat bakteri yang digunakan telah terbukti mampu mendegradasi serat kasar dan termasuk bakteri selulolitik (Astuti, 2010; Gayatri, 2010). Sumber inokulum yang digunakan sebagai salah satu bahan komponen media, terdiri dari dua yaitu cairan rumen sapi segar dari rumah potong hewan PT. Elders dan isolat bakteri rumen. Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah BHI (brain heart infusion), glukosa, cellobiosa, pati, cystein-hcl, hemin, resazurin, agar powder, gas CO 2, larutan McDougall, aquades, larutan HgCl 2, larutan pepsin, HCl, Na 2 CO 3 jenuh, asam borat berindikator, H 2 SO 4 0,005N, NaOH 0,5N, H 2 SO 4, indikator pp (fenoltalen), dan HCl 0,5N. 12
Metode Pembuatan Stock Culture dalam Media BHI Sebanyak 200 ml media BHI awalnya terdiri 7,4 g BHI, pati 0,1 g, glukosa 0,1 g, selubiosa 0,1 g, resazurin 1 ml, dan hemin 1 ml, serta aquades 200 ml. Larutan dipanaskan hingga larut. Setelah itu ditambah resazurin dan hemin masing-masing sebanyak 1 ml, kemudian dialiri dengan gas CO 2 selama 20 menit dan ditambah cystein-hcl 0,1 g. Sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan disterilisasi dalam autoklave selama 15-20 menit (Schelegel, 1994). Media BHI yang telah disterilisasi digunakan sebagai media untuk Stock Culture bakteri. Enam kultur isolat bakteri tunggal yang disimpan di dalam gliserol diambil sebanyal 1 ml masing-masing diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml media BHI kemudian diinkubasi selama 48 jam di dalam shaker water bath dengan suhu 39 o C. Setelah itu, stock culture disimpan di dalam kulkas. Untuk uji kecernaan fermentatif isolat secara in vitro masing-masing isolat bakteri dari stock culture diinokulasikan lagi pada media BHI yang baru sebanyak 1 ml pada tabung reaksi dan diinkubasi selama 48 jam di dalam shaker water bath. Setelah 48 jam enam isolat bakteri tersebut dicampur sambil dialiri CO 2 dan siap digunakan untuk uji in vitro. Pola Pertumbuhan Isolat Informasi pola pertumbuhan isolat bakteri rumen dikaji dengan menunbuhkan enam isolat tunggal bakteri pencerna serat sebanyak 1 ml masing-masing dalam 5 ml media BHI, lalu diinkubasi selama 48 jam dengan pengamatan setiap 4 jam. Pada setiap 4 jam pengamatan diambil sebanyak 0,6 ml bakteri dan dilakukan pengenceran sebanyak lima kali (0,6 ml bakteri ditambah 2,4 ml air aquadest). Kemudian dihitung absorbansinya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm. Hasil yang diperoleh dibuat regresinya. Diperoleh puncak pertumbuhan masing-masing isolat bakteri pada pada inkubasi selama 8 jam. Setelah diketahui pola pertumbuhan individu isolat, individu isolat tersebut ditumbuhkan kembali sebanyak 1 ml masing-masing dalam 5 ml hingga 7 jam atau 1 jam sebelum mencapai puncak pertumbuhan (fase eksponensial). Selanjutnya setiap 13
media tumbuh isolat bakteri individu digunakan sebagai starter untuk membuat bakteri campuran. Bakteri Campuran Bakteri campuran diperoleh dari isolat bakteri tunggal yang ditumbuhkan selama 7 jam dimana masing-masing isolat bakteri tunggal diambil dengan persentase yang berbeda, pertumbuhan bakteri yang paling tinggi jumlahnya (persentasenya) lebih sedikit diinokulasikan dan pertumbuhan bakteri yang paling lambat jumlahnya lebih banyak diinokulasikan. Isolat bakteri campuran ini dimasukkan ke dalam tabung yang berisi media 15 ml media BHI. Kemudian diinkubasi di dalam shaker water bath selama 7 jam. Hasil inkubasi isolat bakteri campuran ini diinokulasikan lagi sebanyak 5% ke dalam tabung yang berisi 100 ml media BHI untuk diamati pertumbuhannya. Pertumbuhan bakteri campuran diinkubasikan selama 10 jam dan populasinya diamati setiap 2 jam. Data pengamatan ini menunjukan bahwa puncak pertumbuhan bakteri campuran adalah 6 jam. Isolat bakteri yang digunakan dalam pengujian penyimpanan dipersiapkan dengan menumbuhkan isolat bakteri campuran pada 5 ml BHI. Sumber isolat yang digunakan adalah media yang pernah ditumbuhkan selama 10 jam. Percobaan 1: Uji Kemampuan Fermentatif Isolat Bakteri In vitro Campuran enam isolat bakteri rumen dibandingkan dengan bakteri cairan asal rumen segar sebagai perlakuan dalam kemampuannya mencerna komponen pakan. Sampel cairan rumen diambil dari sapi yang baru dipotong di Rumah Potong Hewan (RPH) PT. Elders yang terletak dalam kampus Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Isi rumen diperas dan filtratnya dimasukkan ke dalam termos. Sampel cairan rumen dipertahankan pada suhu 39 o C dalam termos hingga digunakan. Bahan pakan yang digunakan adalah rumput Pennisetum purpureum, Panicum maximum, Paspalum notatum, Setaria splendida, Brachiaria humidicola. Kelima Sampel hijauan diperoleh dari kebun koleksi Laboratorium Agrostologi, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan. Sampel ditimbang, kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari selama dua hari dan pengeringan dilanjutkan di dalam oven 60 o C sampai beratnya tetap. Hijauan kering digiling untuk pengukuran kecernaan in vitro, kadar NH 3 dan VFA. 14
Metode Tilley dan Terry (1963) digunakan untuk mengukur kecernaan bahan kering (KCBK) dan kecernaan bahan organik (KCBO), produksi NH 3 dan VFA (volatile fatty acids). Sampel untuk pengukuran konsentrasi NH 3 dan VFA (volatile fatty acids) diperoleh dengan fermentasi 4 jam. Kadar NH 3 ditentukan dengan teknik mikrodifusi conway, dan konsentrasi VFA total diukur dengan teknik destilasi uap. Pengukuran Kecernaan Bahan Kering dan Bahan Organik Tabung fermentor berisi 40 ml larutan McDougall dan 0,5 g sampel rumput dimasukkan ke dalam shaker bath dengan suhu 39 o C. Cairan rumen dimasukkan sebanyak 10 ml dan sebagian tabung uji ditambah cairan rumen steril 5 ml dan 5 ml (5% dari dari media bakteri pada fase eksponensial) campuran enam isolat bakteri cairan rumen kerbau, lalu dikocok dan dialiri gas CO 2 selama 30 detik. Tabung ditutup dengan karet berfentilasi dan difermentasi selama 48 jam. Pada akhir fermentasi (setelah 48 jam) tutup tabung fermentor dibuka dan cairan dicek phnya, kemudian ditambah dua tetes HgCl jenuh untuk mematikan mikroba. Tabung disentrifusi selama sepuluh menit dengan kecepatan 3000 rpm dan endapannya ditambahkan 50 ml larutan pepsin-hcl. Inkubasi dilanjutkan selama 48 jam secara aerob. Akhir inkubasi larutan disaring menggunakan kertas Whatman no. 41 dan dibantu pompa vakum. Hasil saringan dimasukkan ke dalam cawan porselen dan dikeringkan pada 105 o C untuk mengetahui residu bahan kering dan kemudian diabukan di dalam tanur 600 o C untuk menghitung residu bahan organiknya. Kecernaan dihitung dengan rumus: % KCBK = BKsampel (g) (BKresidu(g) BKbalnko(g)) x 100% BKsampel % KCBO = BOsampel (g) (BOresidu(g) BObalnko(g)) x 100% BOsampel Keterangan: BK = bahan kering, BO = bahan organik Pengukuran Konsentrasi NH 3 dan VFA Pengukuran diawali dengan penyiapan sampel cairan dengan memasukkan tabung fermentor berisi 40 ml larutan McDougall, ke dalam shaker bath dengan suhu 39 o C. Sebanyak 0,5 g sampel rumput dimasukkan ke dalam tabung dan diikuti dengan memasukan 10 ml cairan rumen dan sebagian tabung uji diisi 5 ml cairan rumen steril dan 5 ml campuran enam isolat bakteri. Tabung dikocok dan dialiri gas 15
CO 2 selama 30 detik dan ditutup karet berfentilasi dan difermentasi selama empat jam. Pada akhir fermentasi tutup dibuka dan dicek phnya, kemudian ditambah dua tetes HgCl. Tabung disentrifusi selama sepuluh menit dengan kecepatan 3000 rpm dan supernatan diambil untuk analisis NH 3 dan VFA. Pengukuran Konsentrasi NH 3. Konsentrasi NH 3 diukur dengan teknik Mikrodifusi Conway (General Laboratory Procedures, 1969). Bibir cawan conway diolesi dengan vaselin, kemudian larutan NaCO 3 sebanyak sebanyak 1 ml dan diletakkan sebelah kiri dekat cawan, begitu juga dengan supernatan yang dihasilkan dari pencernaan fermentatif diambil sebanyak 1 ml dan diletakkan pada ruang sekat sebelah kanan yang lain. Larutan asam borat berindikator diambil sebanyak 1 ml dan diletakkan pada cawan kecil yang terletak di tengah cawan Conway. Setelah itu, cawan Conway ditutup rapat agar udara tidak dapat masuk, lalu digoyang-goyangkan sehingga larutan Na 2 CO 3 jenuh bersampur dengan supernatan. Kemudian cawan dibiarkan selama 24 jam pada suhu kamar. Setelah 24 jam dibuka dan amonia yang terikat dengan asam borat dititrasi dengan H 2 SO 4 0.005 N sampai warna berubah kemerahmerahan. Kadar N-NH 3 dihitung dengan rumus berikut : N NH 3 = ml H 2 SO 4 x N H 2 SO 4 x 1000 g sampel x BKsampel Pengukuran Volatile Fatty Acid. Konsentrasi VFA diukur dengan metode destilasi uap (General Laboratory Procedures, 1969). Presscooker diisi dengan aquades sampai tanda max, kemudian air pendingin dari kran dialirkan ke tabung destilasi. Air dipanaskan hingga menghasilkan uap yang akan masuk ke tabung-tabung destilasi sehingga analisis VFA dapat dimulai. Supernatan filtrat hasil fermentasi sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung destilasi, setelah itu ditambahkan H 2 SO 4 15% sebanyak 1 ml. Uap panas akan mendesak VFA dalam tabung destilasi dan terkondensasi di dalam pendingin. Destilat ditampung di dalam labu erlenmeyer yang berisi 5 ml NaOH 0,5 N hingga mencapai 250 ml. Indikator phenol pethalein (PP) ditambahkan sebanyak 2 tetes dan ditritasi dengan HCl 0,5 N sampai warna titrat berubah dari merah menjadi merah muda. Produksi VFA total dihitung dengan rumus: mm VFA total = (a-b) x N HCl x 1000/5; a = volume titran blanko, b = volume titran contoh. 16
Rancangan Percobaan Nilai KCBK dan KCBO rumput, kadar NH 3, VFA dan ph media fermentasi menggunakan dua sumber bakteri dibandingkan secara statistik. Metoda pengolahan menggunakan Uji-t berpasangan. Percobaan 2: Uji Viability Isolat Bakteri Selama Penyimpanan Peubah yang Diamati Peubah yang diamati yaitu jumlah koloni bakteri pada masing-masing media penyimpan setelah periode penyimpanan berakhir. Rancangan Percobaan Percobaan kedua menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial (4 x 3) dengan 3 ulangan. Faktor A yaitu media penyimpan (tanah, arang, tepung tapioka dan UMB). Media penyimpanan digunakan untuk menyimpan campuran enam isolat bakteri. Faktor B yaitu waktu penyimpanan (0,1 dan 2 minggu). Model matematik yang digunakan dalam analisa statistik adalah: X ijk = μ + α i + β j + γ ij + ε ijk Keterangan: X ijk = Nilai pengamatan faktor A ke -i, faktor B ke-j dan ulangan ke-k μ = Nilai rataan umum α i = Pengaruh faktor media simpan ke-i (i= 0,1,2,3,) β j = Pengaruh faktor waktu simpan ke-j (j= 0,1,2) γ ij = Pengaruh interaksi antara faktor A (media simpan) ke-i dan faktor B (waktu simpan) ke-j ε ijk = Error (galat) ke-i, ke-j dan ke-k. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan sidik ragam (Analysis of Variance) berdasarkan Mattjik dan Sumertajaya (2002). Selanjutnya, jika setiap perlakuan berbeda nyata maka dilakukan uji jarak Duncan. 17
Penyiapan Media Penyimpanan Empat bahan media yang digunakan yaitu tanah, arang, tepung, dan UMB. Tiga bahan media penyimpan yaitu tanah, arang, dan UMB dihaluskan, kemudian diayak, sedangkan tapioka yang diperoleh sudah dalam bentuk tepung halus. Bahan media kemudian dipanaskan dengan oven pada suhu 105 o C untuk mendapatkan bahan kering (BK) tiap-tiap bahan. Selanjutnya bahan yang telah di oven tersebut ditimbang masing-masing 20 g di dalam plastik, dialiri gas CO 2, plastik direkatkan menggunakan menggunakan sealer. Kemudian semua bahan disterilisasi selama 1 jam menggunakan autoclave pada suhu 121 o C selama 15 menit. Bahan media dalam plastik yang telah disterilisasi masing-masing ditambah dengan 2 ml campuran bakteri (10% dari BK), kemudian bahan yang sudah ditambahkan bakteri disimpan selama 0, 1, dan 2 minggu. Pada minggu ke 0, 1, dan 2 dilakukan penghitungan bakteri menggunakan metode TPC (Total Plate Count) dengan cara mengambil 1 g bahan dan ditambahkan 9 ml larutan pengencer secara bertahap. Pengenceran dilakukan sampai pengenceran ke tujuh, kemudian larutan diambil sebanyak 0,1 ml dimasukan pada media BHI agar untuk menumbuhkan bakterinya. Pada hari ke 3 periode penumbuhan, jumlah bakteri yang tumbuh dihitung. 18