MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan IPB dan Laboratorium Terpadu, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan IPB. Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari sampai dengan bulan Mei 2012. Materi Sampel Sampel darah sebagai sumber DNA diambil dari ayam, puyuh, itik dan merpati. Sedangkan sampel bulu diambil dari beo nias, kakatua maluku, kakatuakecil Jambul-kuning. Sumber dan jumlah masing-masing tersebut ditunjukkan pada Tabel 2, sedangkan gambar sampel-sampel Aves yang digunakan ditunjukkan pada Gambar 3. Bahan-bahan yang digunakan dalam mengambil sampel darah diantaranya kapas, alkohol dan EDTA. Alat-alat yang dibutuhkan diantaranya spoit, pipa kapiler haematokrit dan tabung 1,5 ml. Sedangkan untuk menyimpan sampel bulu digunakan plastik seal kemudian disimpan di dalam freezer. Tabel 2. Sampel Aves yang Digunakan dalam Penelitian Jenis Aves Lokasi Pengambilan Sampel Jenis Sampel Ayam Kampung Puyuh jepang Itik Merpati Beo nias Kakatua maluku Kakatua-kecil Jambul-kuning Kandang ABC Fakultas Peternakan IPB Kandang B Fakultas Peternakan IPB Kandang B Fakultas Peternakan IPB Dramaga, Bogor Penangkaran Burung Megananda Bird Orchid Farm (MBOF), Ciluer, Bogor Penangkaran Burung Megananda Bird Orchid Farm (MBOF), Ciluer, Bogor Penangkaran Burung Megananda Bird Orchid Farm (MBOF), Ciluer, Bogor Bulu Bulu Bulu Jumlah (ekor) Jenis Kelamin tidak diketahui - - 1 - - 2 - - 2
A.1 A.2 B.1 B.2 C D E F Gambar 3. Sampel Aves yang Digunakan dalam Penelitian: (A.1) Ayam Kampung Jantan, (A.2) Ayam Kampung Betina, (B.1) Puyuh Jantan, (B.2) Puyuh Betina, (C) Itik, (D) Merpati, (E) Beo Nias, (F) Kakatua Maluku, dan (G) Kakatua kecil-jambul kuning Sumber : Dokumentasi Pribadi G 13
Ekstraksi DNA Total Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk ekstraksi DNA dari sampel darah diantaranya RBC lysis buffer, buffer 1x STE, SDS (Sodium Dodesil Sulfat) 10%, Proteinase K (5 mg/ml), phenol, CIAA (Chloroform Isoamil Alkohol), NaCl (5 M), EtOH 96% dan TE 80%. Peralatan yang digunakan diantaranya satu set micropippet beserta tipnya, vortex, sentrifuge, inkubator, dan freezer. Ekstraksi DNA dari sampel bulu menggunakan bahan-bahan Yang with Urea, Proteinase K (10 mg/ml), PB Buffer, PE Buffer, dan Elution Buffer. Alat-alat yang digunakan diantaranya satu set micropippet beserta tipnya, sentrifuge, inkubator, tabung spin, tabung 1,5 ml dan spektrofotometer. Polymerase Chain Reaction Bahan-bahan yang digunakan dalam PCR adalah sampel DNA, destilation water, 10 x buffer, MgCl 2, pasangan primer forward dan reverse, enzim Taq polymerase dan dntps. Alat-alat yang digunakan diantaranya mesin PCR thermocycler, vortex, micro sentrifuge, tabung PCR, satu set mikopipet dan tipnya, dan refrigerator. Primer yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan Fridolfsson dan Ellegren (1999) yaitu 2550F dan 2718R yang terdiri dari: primer forward: 5 -GTT ACT GAT TCG TCT ACG AGA-3 dan primer reverse: 5 -ATT GAA ATG ATC CAG TGC TTG-3. Sekuen gen CHD diperoleh dari NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Nomor akses dari sekuen gen CHD-Z dan CHD-W merpati masing-masing adalah AY517719 dan AY517718. Nomor akses dari sekuen gen CHD-Z dan CHD-W pada ayam Hutan masing-masing adalah GU132943 dan GU132944. Agarose Gel Electrophoresis Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat agarose gel 1,5% diantaranya larutan 0,5 x TBE (Tris-Borat EDTA) 30 ml, serbuk agarose 0,45 gram, EtBr 2,5 μl. Bahan-bahan lainnya yang dibutuhkan dalam elektroforesis menggunakan gel agarose adalah sampel DNA hasil PCR, loading dye (0,01% Xylene Cyanol, 0,01% Bromtimol Blue, 50% gliserol), dan marker 100 bp. Peralatan yang digunakan 14
diantaranya satu set tray pencetak gel, timbangan digital, power supply 100 volt, pipet mikro, tip, beaker glass, microwave, stirrer, dan UV Transilluminator. Prosedur Pengambilan Sampel dan Bulu Sampel darah diperoleh dengan mengambil darah menggunakan spoit atau pipa kapiler haematokrit di vena axillaris bagian sayap. Bagian kulit yang akan diambil darahnya dioles alkohol terlebih dahulu. yang diambil sebanyak 1,5 ml kemudian dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml dan dicampur dengan serbuk EDTA agar tidak menggumpal. Sampel darah disimpan dalam refrigerator (suhu + 4 o C) sebelum diproses lebih lanjut. Sedangkan sampel bulu yang didapatkan segera dikemas dalam plastik seal dan disimpan di dalam freezer sebelum diekstraksi. Ekstraksi DNA Total Sampel. Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan acuan Sambrook et al. (1989) yang dimodifikasi. Sebanyak 50 µl darah ditambahkan dengan 800 µl RBC lysis buffer, kemudian disentrifugasi 800 rpm selama lima menit hingga terbentuk endapan. Endapan tersebut ditambah dengan 1 x STE sebanyak 300 µl, 40 µl 10% SDS dan 10 µl Proteinase K 5 mg/ml lalu diinkubasi selama dua jam dengan suhu 55 o C. Setelah itu ditambahkan 400 µl phenol, 400 µl CIAA dan 40 µl NaCl 5M, kemudian digoyang pelan di suhu ruang selama satu jam. Tahap selanjutnya adalah sentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama lima menit. Sebanyak 400 µl cairan bening di lapisan paling atas dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 800 µl EtOH absolut (70%) dan 40 µl NaCl 5 M lalu dibekukan selama 12 jam. Sampel kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama lima menit dan terbentuk endapan putih. Endapan tersebut ditiriskan dan ditambah dengan 100 µl TE 80%. Sampel Bulu. Sampel bulu bagian calamus (Gambar 4) dipotong kecil dan masingmasing ditambahkan 1000 µl Yang with Urea dan 100 µl Proteinase K (10 mg/ml) lalu diinkubasi selama 12 jam pada suhu 38 o C. Selanjutnya, sampel ditambahkan dengan 20 µl Proteinase K (10 mg/ml) dan diinkubasi pada suhu 55 o C selama dua jam. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama lima menit. Sebanyak 15
500 µl sampel diambil, kemudian ditambahkan dengan 2500 µl PB Buffer. Campuran tersebut dipindahkan ke tabung spin column sebanyak 750 µl dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. Tahapan ini diulangi hingga seluruh campuran sampel dan PB Buffer habis. Sebanyak 750 µl PE Buffer dimasukkan ke dalam tabung spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. Kemudian ditambahkan 50 µl Elution Buffer pada tabung spin column. Selanjutnya, sampel didiamkan selama lima menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. Sebanyak 50 µl Elution Buffer ditambahkan kembali dan didiamkan selama lima menit, kemudian disentrifugasi. Calamus Gambar 4. Bagian Calamus pada Bulu Aves Sumber : Dokumentasi Pribadi Uji Kualitas DNA. Kualitas DNA hasil ekstraksi diukur kemurnian dan konsentrasinya menggunakan spektrofotometer. Selain itu, secara kualitatif kualitas DNA dapat dilihat dengan elektroforesis menggunakan agarose gel 1,5%. Polymerase Chain Reaction (PCR) Sampel DNA hasil ekstraksi diambil sebanyak 0,1-2 µl ditambah dengan premix dengan volume 23 µl. Premix dibuat dengan campuran 0,3 µl primer; 0,2 µl dntps; 1 µl MgCl 2 ; 2,5 µl 10 x buffer; 0,1 µl enzim Taq polymerase; dan 18,9 µl destilation water. Campuran sampel DNA dan premix tersebut diinkubasi menggunakan mesin PCR thermocycler. Proses amplifikasi diawali tahap denaturasi pada suhu 94 o C selama lima menit. Tahap kedua terdiri dari 30 siklus, masingmasing siklus terdiri dari proses denaturasi pada suhu 94 o C selama 30 detik, annealing primer pada suhu 60 o C selama 45 detik dan ekstensi DNA pada suhu 72 16
o C selama satu menit. Tahapan terakhir adalah pemanjangan primer pada suhu 72 o C selama sepuluh menit. Hasil amplifikasi DNA tersebut divisualisasi dengan elektroforesis. Elektroforesis DNA hasil amplifikasi dielelektroforesis menggunakan agarose gel dengan konsentrasi 1,5%. Sebanyak 0,45 g serbuk agarose ditambahkan dengan 30 ml 0,5 x TBE. Campuran tersebut dipanaskan hingga mendidih dan ditambahkan dengan 2,5 µl EtBr, kemudian dicetak pada cetakan hingga mengeras. Masing-masing sampel DNA hasil PCR sebanyak 5 µl ditambahkan dengan 1 µl loading dye dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur di dalam gel, kemudian di-running pada larutan 0,5 x TBE dengan voltase 100 volt selama kurang lebih 30-45 menit. Pita-pita DNA akan tampak dengan bantuan sinar ultra violet pada UV Transilluminator. Rancangan dan Analisa Data Genotyping Jenis kelamin pada Aves ditentukan dengan jumlah pita hasil elektroforesis. Pita tunggal menunjukkan jenis kelamin jantan, dan pita ganda menujukkan jenis kelamin betina (Cerit dan Avanus, 2007). 17