8 pertumbuhan dan kurva produksi yang menunjukkan waktu optimum produksi xilitol. Optimasi Konsentrasi Substrat (Xilosa) Prosedur dilakukan menurut metode Eken dan Cavusoglu (1998). Sebanyak 1% Sel C.tropicalis dari inokulum dimasukkan ke dalam media fermentasi xilosa. Media fermentasi dibuat dengan variasi konsentrasi substrat berkisar antara 30-110g/L, yaitu 30, 50, 70, 90 dan 110 g/l. Media diperlakukan pada ph 5, kecepatan pengocokan 120 rpm, dan suhu 30 o C. Sel khamir C.tropicalis ditumbuhkan pada media fermentasi sebanyak 50 ml dalam labu Erlenmeyer 125 ml dengan waktu inkubasi optimum yang diperoleh dari percobaan sebelumnya yaitu 48 jam, kemudian diukur kadar xilitol pada panjang gelombang 492 nm. Optimasi Konsentrasi Ko-substrat (Glukosa) Pada percobaan sebelumnya telah diperoleh waktu inkubasi dan konsentrasi xilosa optimum untuk produksi xilitol. Selain itu konsentrasi ko-substrat juga diperlukan untuk meningkatkan produksi xilitol. Sehingga perlu dilakukan optimasi konsentrasi ko-substrat. Ko-substrat yang digunakan yaitu glukosa. Prosedur dilakukan menurut metode Yulianto et al. (2006). C.tropicalis ditumbuhkan pada media fermentasi campuran xilosa dengan glukosa. Sebanyak 50 ml di dalam labu Erlenmeyer 125 ml, dengan komposisi (g/l): ekstrak khamir 10; pepton 20; K 2 HPO 4 0.5; KH 2 PO 4 0.5; MgSO 4.7H 2 O 0.5 dan ammonium sulfat 2, kemudian ditambahkan campuran xilosa dan glukosa dengan perbandingan 6:1, 6:2, 6:3, dan 6:4 (%), yaitu dengan penambahan glukosa berkisar 12 48 g/l pada konsentrasi xilosa optimum. Setelah itu media diperlakukan pada ph 5, suhu 30 o C kecepatan pengocokan 120 rpm, dengan waktu inkubasi 48 jam. Konsentrasi substrat yang digunakan adalah konsentrasi xilosa optimum yang telah diperoleh dari percobaan sebelumnya. Kemudian diukur kadar xilitolnya pada panjang gelombang 492 nm. Penentuan Kadar Xilitol dengan Metode Kit (Roche) Pengukuran kadar xilitol dilakukan menggunakan metode spektrofotometri (metode Kit D-sorbitol/D-xilitol dari Roche). Metode ini dilakukan di dalam tabung Eppendorf. Sebanyak 0.6 ml dimasukkan larutan 1 dalam tabung Eppendorf, kemudian ditambahkan larutan 2 sebanyak 0.2 ml, larutan 3 sebanyak 0.2 ml, sampel yang telah diencerkan sebesar 50x sebanyak 0.1 ml, dan aquabides sebanyak 1.9 ml, kemudian divortex agar homogen. Setelah itu dibiarkan selama 2 menit, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 492 nm, setelah 2 menit dilakukan pengukuran kembali. Pengukuran yang dilakukan disebut sebagai absorban pertama. Kemudian ditambahkan larutan 4 sebanyak 0.05 ml dan dibiarkan selama 30 menit, setelah itu diukur kembali absorbansinya. Kemudian setiap interval 5 menit dari menit ke-30 hingga menit ke-55, dilakukan 5 kali pengukuran. Pengukuran ini disebut absorbansi kedua. Konsentrasi xilitol yang terukur, diperoleh sesuai dengan perhitungan yang terdapat pada Kit (Lampiran 5). Larutan yang digunakan disajikan pada Lampiran 2. Biomasa Sel Khamir Candida tropicalis pada Variasi Konsentrasi Xilosa dan Kosubstrat (Glukosa) Prosedur yang dilakukan sama seperti pembuatan kurva pertumbuhan. Media fermentasi yang digunakan yaitu media yang mengandung 70 g/l xilosa sebagai kontrol, variasi campuran konsentrasi xilosa dan kosubstrat (glukosa) dengan perbandingan 6:1, 6:2, 6:3, dan 6:4 (%). Masing-masing dibuat di dalam labu Erlenmeyer 125 ml sebanyak 50 ml. Setelah itu diinkubasi selama 48 jam, dengan kecepatan pengocokan 120 rpm, pada suhu 30 o C. Pengukuran nilai optical density (OD) dilakukan setiap 12 jam sekali pada panjang gelombang 600 nm. Dari data percobaan ini diperoleh 5 data kurva pertumbuhan pada konsentrasi media yang berbeda-beda. HASIL DAN PEMBAHASAN Pertumbuhan Sel Candida tropicalis dan Produksi Xilitol Sel Candida tropicalis sebelum digunakan diremajakan terlebih dahulu setiap 4 minggu sekali dalam media Yeast Malt (YM). Media YM merupakan salah satu media yang spesifik untuk pertumbuhan khamir, salah satunya yaitu Candida. Media ini berisi ekstrak khamir, ekstrak malt, dan bakto pepton yang berperan sebagai sumber nitrogen. Ekstrak khamir terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alkohol, serta
9 mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B kompleks). Pepton menurut Fathir (2009) mampu menyediakan nutrien esensial untuk metabolisme bakteri. Selain itu media YM juga mengandung glukosa yang berperan sebagai sumber karbon bagi Candida. Penelitian ini dimulai dari pembuatan kurva pertumbuhan Candida tropicalis dengan menggunakan media Yeast Malt (YM). Pembuatan kurva pertumbuhan dilakukan untuk menentukan waktu inkubasi pertumbuhan optimal sel khamir Candida tropicalis. Pertumbuhan sel paling aktif ketika berada pada fase log, yaitu fase disaat metabolisme sel paling aktif serta sintesis bahan sel sangat cepat dengan jumlah konstan sampai nutrien habis atau terjadinya penimbunan hasil metabolisme yang menyebabkan terhambatnya pertumbuhan, sehingga pertumbuhan sel berada pada fase stationer, kemudian menuju pada fase kematian. Tetapi pada penelitian ini, kurva pertumbuhan yang diperoleh tidak sampai berada pada fase kematian, tetapi hanya sampai pada persimpangan antara fase log dengan fase stationer. Pembuatan kurva pertumbuhan dilakukan dengan pengamatan setiap 12 jam sekali sampai jam ke-72, karena kecepatan pertumbuhan khamir lebih lambat dibandingkan dengan bakteri yang membelah setiap 2 jam sekali. Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh pola pertumbuhan yang sigmoid (Gambar 5a), yang sama dengan pola pertumbuhan mikroorganisme pada umumnya. Gambar 5a menunjukkan bahwa fase adaptasi (lag phase) berada pada jam ke- 0 hingga jam ke-12, fase log (eksponensial) berada pada kisaran jam ke-12 hingga jam ke-24. Pertumbuhan sel mulai lambat ketika memasuki fase pertumbuhan akhir yaitu dimulai pada jam ke-24. Fase-fase pada pola pertumbuhan mikroorganisme juga menunjukkan hasil metabolitnya. Metabolit primer dihasilkan oleh sel ketika berada pada fase log, dan xilitol dalam penelitian ini merupakan hasil metabolisme primer khamir, sedangkan metabolit sekunder dihasilkan ketika sel berada pada fase stationer. Pertumbuhan sel maksimal ketika berada pada fase log, sehingga pada fase ini dihasilkan sel khamir C. tropicalis dalam jumlah yang besar, yang berkorelasi positif terhadap xilitol yang akan dihasilkan, ketika diproduksi pada media fermentasi. Semakin besar konsentrasi sel maka xilitol yang dihasilkan juga semakin besar, sehingga waktu inkubasi 18 jam merupakan waktu inkubasi yang mewakili fase log untuk pertumbuhan Candida tropicalis, dan pada waktu ini sel berada dalam kondisi yang sangat aktif untuk membelah. Kurva pertumbuhan Candida topicalis menunjukkan bahwa pertumbuhan khamir cukup lambat, bahkan pada jam ke-72 masih mengalami peningkatan, sehingga tidak dapat dipastikan waktu ketika memasuki fase stationer, yaitu fase pada saat jumlah sel hidup sama dengan jumlah sel yang mati atau pertumbuhan sama dengan nol. Setelah memasuki fase pertumbuhan akhir, pertumbuhan Candida tropicalis semakin lambat, hal ini menunjukkan bahwa nutrisi yang disediakan oleh media YM mengalami penurunan, ditambah lagi dengan adanya penimbunan hasil metabolisme. Sehingga dapat dikatakan bahwa pada Candida, pertumbuhan optimal sel berada pada fase log. Berdasarkan hasil penentuan kurva produksi xilitol yang disajikan pada Gambar 5, menunjukkan bahwa produksi xilitol berkorelasi positif terhadap pertumbuhan sel khamir C.tropicalis. Semakin besar biomasa sel maka semakin besar juga xilitol yang dihasilkan (Gambar 5b). Tetapi pada waktu inkubasi jam ke-60 xilitol yang dihasilkan sudah mengalami penurunan, walaupun pada jam ke-72 mengalami peningkatan yang tidak terlalu tinggi. b Gambar 5 Pembentukan biomasa sel Candida tropicalis (a) dan produksi xilitol (b).
10 Menurut Yulianto (2001), tipe fermentasi ini dikenal sebagai pertumbuhan associated. Berdasarkan hasil percobaan menunjukkan bahwa produksi xilitol tertinggi pada fermentasi yang dilakukan oleh Candida tropicalis yaitu pada jam ke-48 sebesar 1.14 g/l, dan hasil terendah sebesar 0.73 g/l pada jam ke-12. Waktu inkubasi dengan produksi xilitol tertinggi digunakan sebagai waktu inkubasi optimum untuk produksi xilitol. Konsentrasi Xilosa Optimum dalam Produksi Xilitol Hasil produksi xilitol pada media fermentasi Candida tropicalis pada konsentrasi xilosa 30g/L, 50g/L, 70 g/l, 90 g/l, dan 110 g/l dengan waktu inkubasi 48 jam, disajikan pada Tabel 2. Berdasarkan hasil percobaan dapat menunjukkan product yield dan efisiensi biokonversi xilosa menjadi xilitol. Efesiensi biokonversi xilosa menjadi xilitol optimum dihasilkan pada konsentrasi xilosa 70 g/l, sebesar 14.08 g/l dengan product yield (Y p/s) sebesar 0.20 g/g, sedangkan pada konsentrasi 90 g/l dan 110 g/l biokonversi xilitolnya lebih rendah dibandingkan dengan konsentrasi xilosa 70g/L, yaitu 10.08g/L (Y p/s = 0.11g/g) dan 11.82 g/l (Y p/s = 0.11 g/g). Akan tetapi jika dilihat dari product yield konsentrasi xilosa 30 g/l paling tinggi yaitu sebesar 0.25 g/g meskipun biokonversinya kecil, hanya sebesar 7.49 g/l. Sedangkan penelitian yang dilakukan oleh Eken dan Cavusoglu (1998) menggunakan konsentrasi xilosa 50-100g/L, dihasilkan produksi xilitol tertinggi pada konsentrasi xilosa 50g/L, yaitu sebesar 13 g/l (Y p/s = 0.260 g/g xilosa). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa biokonversi xilosa menjadi xilitol meningkat pada kisaran 30-70 g/l xilosa dengan product yield tertinggi pada konsentrasi xilosa 30 g/l, sehingga pada penelitian ini konsentrasi xilosa yang baik untuk memproduksi xilitol pada kisaran 30-70 g/l xilosa, sedangkan pada konsentrasi lebih dari 90 g/l, biokonversi dan product yield-nya rendah. Menurut Meyrial et al. (1991) untuk spesies Candida yang lain yaitu Candida guilliermondii, produksi xilitol tertinggi pada kisaran 20 50 g/l xilosa atau 5-10 g/l konsentrasi xilosa untuk Candida mogii (Sirisansaneeyakul et al. 1995). Konsentrasi xilosa berkisar antara 30-110 g/l didasarkan pada literatur, bahwa xilosa memiliki batas maksimum penggunaan, jika melewati batas optimal maka xilosa akan menjadi inhibitor bagi produksi xilitol. Menurut Meyrial et al. (1991) konsentrasi xilosa antara 150-200 g/l dapat menjadi inhibitor bagi produksi xilitol untuk C. guilliermondii dan C. boidinii. Xilosa dapat menurunkan produktivitas dan menghambat produksi xilitol pada konsentrasi xilosa yang meningkat dari 100 150 g/l, karena adanya penimbunan hasil metabolisme (Thonart et al. 1987; Meyrial et al. 1991; Vandeska et al. 1995). Menurut penelitian yang dilakukan oleh Prior et al. (1989), bahwa selama fermentasi xilosa oleh Candida sp, selain dihasilkan produk (xilitol) dan biomasa, juga terbentuk produk samping seperti etanol dan asam asetat. Keadaan ini tidak menguntungkan karena dapat menurunkan product yield. Xilitol dihasilkan dari biokonversi xilosa menjadi xilitol, dan besarnya xilitol yang dihasilkan dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu konsentrasi substrat dan kosubstrat, ph, temperatur, aerasi (Sanchez et al. 2004) dan yang paling penting adalah kemampuan Candida tropicalis dalam mengkonversi xilosa menjadi xilitol dengan bantuan enzim XR (Xilose Reductase) juga dipengaruhi kondisi lingkungan asal sel khamir Candida tropicalis. Walaupun konsentrasi substrat besar, tetapi jika kemampuan dari mikroorganisme untuk mengkonversi rendah, maka efisiensi penggunaan substrat (xilosa) pun tidak optimal. Tabel 2 Data produksi xilitol pada variasi konsentrasi xilosa [xilosa] g/l [xilitol] g/l Y (p/s) 30 7.49 0.25 50 11.12 0.22 70 14.08 0.20 90 10.08 0.11 110 11.82 0.11 Y p/s = product yield (g xilitol dihasilkan / g xilosa yang dikonsumsi) Konsentrasi Ko-substrat (Glukosa) Optimum dalam Produksi Xilitol Glukosa digunakan sebagai kosubstrat untuk mencegah xilitol sebagai produk utama dimetabolisme lebih lanjut untuk pertumbuhan sel, yang akan berakibat menurunnya produksi xilitol. Selain itu juga
11 dapat digunakan untuk menyediakan koenzim (NADH/NADPH) dan suplai energi untuk kehidupan sel Candida tropicalis (Hallborn et al. 1994). Hasil penelitian yang disajikan pada Tabel 3 menunjukkan bahwa penambahan ko-substrat berupa senyawa glukosa (heksosa) sebesar 12-48 g/l pada media fermentasi xilosa, hanya menghasilkan xilitol 1.43-4.81 g/l. Sementara pada kontrol (xilosa saja) mencapai 14.08 g/l. Hasil ini memperkuat penelitian yang dilakukan oleh Yulianto (2006) bahwa penambahan kosubstrat berupa glukosa menurunkan produksi xilitol dan produknya hanya 27.5 31,1 g/l. Sementara pada kontrol (xilosa saja) mencapai 43.4 /L. Penurunan rasio 6:1% sampai 6:4%, mengurangi produksi xilitol dari 4.81 g/l menjadi 1.43 g/l. Hasil penelitian juga menunjukkan rasio substrat dan ko-substrat yang paling tinggi produksi xilitolnya yaitu 6:1%, sebesar 4.81 g/l, dengan penambahan konsentrasi glukosa 12 g/l. Penambahan kadar glukosa sampai 48g/L sebagai ko-substrat ke dalam substrat xilosa 70g/L tidak meningkatkan produksi xilitol, tetapi hanya meningkatkan biomasa sel pada inkubasi 48 jam dengan optical density (OD) berkisar 2.316-3.192 ketika rasio xilosa dan glukosa diubah dari 6:1% menjadi 6:4%. Hasil ini sejalan dengan hasil penelitian Silva et al. (1996) yang melaporkan efisiensi konversi xilosa menjadi xilitol oleh C.guilliermondii hanya sebesar 45% ketika ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa 1.5% dan xilosa 6.5%, tetapi dapat meningkat sampai 66% jika tanpa glukosa. Hasil percobaan pada Gambar 6 menunjukkan bahwa penurunan xilitol signifikan terjadi dari rasio 6:1% menuju 6:2%, dan terlihat bahwa penambahan kosubstrat tidak mempengaruhi terjadinya peningkatan produksi xilitol. Menurut Yahashi et al. (1996) glukosa akan menghambat penggunaan xilosa sampai ketersediaan glukosa habis, kemudian sel akan menggunakan xilosa untuk pertumbuhan sel dan produksi xilitol. Selain itu, Yulianto (2006) mengungkapkan penelitian yang dilakukan oleh Prior et al. (1989) bahwa selama fermentasi xilosa oleh Candida tropicalis, selain dihasilkan xilitol dan biomassa sel, juga terbentuk produk samping seperti etanol dan asam asetat. Keadaan ini tidak menguntungkan karena dapat menurunkan produksi xilitol. Yulianto (2006) juga menyatakan bahwa penambahan glukosa yang semakin tinggi juga dapat meningkatkan produksi etanol. Keadaan ini menyebabkan arah pembentukan produk utama (xilitol) menjadi berkurang, karena glukosa-6-fosfat (Glu-6P) dalam lintasan heksosa monofosfat untuk menghasilkan NADH/NADPH yang digunakan untuk biokonversi xilosa menjadi xilitol, digunakan untuk pembentukan etanol. Sehingga semakin tinggi konsentrasi glukosa yang ditambahkan maka konsumsi xilosa akan semakin terhambat dan xilitol yang dihasilkan semakin berkurang. Tabel 3 Data produksi xilitol pada konsentrasi xilosa 70g/L dengan penambahan variasi [glukosa] Rasio [glukosa] [xilitol] xilosa:glukosa g/l g/l 6:0 0 14.08 6:1 12 4.81 6:2 24 1.43 6:3 36 1.98 6:4 48 1.87 Gambar 6 Produksi xilitol optimum oleh Candida tropicalis pada konsentrasi xilosa 70 g/l dengan penambahan variasi [glukosa].
12 Hasil penelitian yang disajikan pada Gambar 7 menunjukkan pertumbuhan sel sejalan dengan konsentrasi glukosa yang digunakan, dan hal ini sesuai dengan peran ko-substrat untuk meningkatkan biomasa sel. Yahashi et al. (1996); Halborn et al. (1994) mengungkapkan bahwa glukosa dipilih sebagai sumber karbon, karena digunakan lebih cepat dan lebih mudah oleh khamir dibandingkan xilosa untuk pertumbuhan sel. Selain itu, glukosa dimetabolisme kembali pada lintasan pentosa fosfat menghasilkan NADPH yang digunakan untuk reduksi xilosa menjadi xilitol, serta untuk suplai energi dalam pemeliharaan metabolisme sel. Menurut Yahashi et al. (1996) konsentrasi sel lebih tinggi pada substrat glukosa dibandingkan dengan menggunakan substrat xilosa, fermentasi selama 9.5 jam dihasilkan 11g/L dan xilosa selama 12 jam menghasilkan 8.4 g/l. Semakin tinggi glukosa yang ditambahkan maka pertumbuhan sel Candida tropicalis semakin besar. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa konsentrasi glukosa optimum yang digunakan sebagai ko-substrat, yaitu 12 g/l untuk kadar xilosa 70g/L, dan penambahan kadar glukosa sampai 48 g/l cenderung menurunkan produksi xilitol. Hal ini disebabkan terhambatnya konsumsi xilosa sehingga produksi xilitol menjadi lambat. Tochampa et al. (2005) menyatakan bahwa konsentrasi glukosa yang tinggi dapat menghambat transport xilosa ke dalam sel, sehingga mengakibatkan efisiensi biokonversi xilosa menjadi xilitol juga terhambat. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Berdasarkan hasil penelitian diperoleh kondisi optimum untuk produksi xilitol, yaitu waktu inkubasi optimum 48 jam, konsentrasi xilosa yang baik untuk memproduksi xilitol pada kisaran 30-70 g/l dengan product yield tertinggi pada konsentrasi xilosa 30 g/l (Y p/s = 0.25 g/g) dan rasio optimum xilosa dan glukosa 6:1% menghasilkan xilitol sebesar 4.81 g/l, dengan penambahan glukosa sebesar 12 g/l. Hasil penelitian menunjukkan rasio xilosa dan glukosa tertinggi yaitu 6:1 %, akan tetapi xilitol yang dihasilkan masih lebih rendah jika dibandingkan dengan kontrol (xilosa saja). Sehingga dapat disimpulkan bahwa penambahan ko-substrat berupa glukosa pada media xilosa tidak meningkatkan produksi xilitol, tetapi berperan untuk meningkatkan biomasa sel. Saran Penelitian lanjutan dengan cara penambahan ko-substrat yang lain seperti arabinosa perlu dilakukan untuk mengetahui pengaruh sebagai ko-substrat terhadap produksi xilitol dengan menggunakan kondisi optimum yang sama, sehingga dapat digunakan sebagai acuan memproduksi xilitol dengan media hidrolisat ampas tebu. Selain itu untuk mengetahui kadar xilitol yang dihasilkan lebih tinggi atau lebih rendah dari penelitian diatas perlu dilakukan penambahan kadar ko-substrat berupa glukosa dengan konsentrasi dibawah 12 g/l dengan kondisi optimum yang sama. DAFTAR PUSTAKA Ahmed Z. 2001. Production of natural and rate pentoses using microorganisms and their enzymes. Electronic Journal of Biotechnology 4:2. Gambar 7 Pembentukan biomasa sel Candida tropicalis pada rasio xilosa : glukosa 6:1 6:4(%) selama 48 jam inkubasi. Barbosa MFS, Medeiros MB, Mancilha LM, Schneider H, Lee H. 1988. Screening of yeast for production of xylitol from D-xylose and some factor which affect xylitol yield in Candida guillirmondii. J Ind Microbial 3: 241-251. Carvalho W, Silva SS, Vitolo M, Felipe MGA, Manchilha IM. 2000. Use of