KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN DIREKTORAT JENDERAL PENDIDIKAN MENENGAH DIREKTORAT PEMBINAAN SEKOLAH MENENGAH ATAS Test Seleksi Calon Peserta International Biology Olympiad (IBO) 2014 2 8 September 2013 Bandung, Jawa Barat TES PRAKTIKUM 1 Tugas III Isolasi Plasmid dan Analisis Restriksi Enzim Durasi: 40 Menit www.tobi.or.id
Tugas III Isolasi Plasmid dan Analisis Restriksi Enzim Dr. Wibowo adalah seorang peneliti yang sedang melakukan penelitian untuk mengisolasi dan mengarakterisasi gen GFP (green fluorescence protein) yang panjangnya 750 pb. Dia telah berhasil mengisolasi dan kemudian menyisipkan gen GFP tersebut ke dalam suatu vektor kloning pgem-t easy (3000 pb) pada daerah pemotongan enzim restriksi EcoRI. Gen GFP tersebut kemudian diperbanyak secara in vivo dalam bakteri E. coli. Sebelum dipergunakan untuk analisis lebih lanjut, Dr. Wibowo ingin memastikan bahwa bakteri E. coli yang telah ditransformasi telah benar-benar mengandung plasmid pgem-t easy berisi gen GFP. Tugas: Pada percobaan ini anda diberikan endapan (pelet) bakteri transforman dan akan melakukan konfirmasi keberadaan gen GFP dalam vektor kloning pgem-t easy menggunakan metode analisis restriksi. Untuk keperluan tersebut anda akan melakukan isolasi plamid dari E. coli transforman berisi plasmid rekombinan yang telah dikultur oleh Dr. Wibowo, kemudian dilanjutkan dengan pemotongan plasmid rekombinan menggunakan enzim restriksi EcoRI fast digest. Plasmid rekombinan yang dipotong tersebut akan menghasilkan dua pita DNA linier dengan ukuran 3000 pb dan 750 pb. 1. Waktu ujian isolasi plasmid dan analisis restriksi enzim adalah 40. 2. Sentrifugasi pertama akan dimulai 7 sejak tes dimulai. 3. Bacalah protokol yang diberikan dengan baik. Waktu menunggu sentrifugasi dapat anda gunakan untuk menyiapkan alat/bahan untuk tahapan setelahnya. 4. Sentrifugasi hanya dilakukan pada saat tertentu dan akan diingatkan secara berkala oleh asisten. Waktu antar sentrifugasi terbatas, jadi gunakan waktu luang anda sebaik mungkin. Tertinggal sentrifugasi menyebabkan nilai anda untuk praktikum isolasi plasmid dan analisis restriksi enzim Biologi Sel dan = 0. 5. Jangan lupa memberi label No meja pada sampel hasil isolasi. 6. Saat proses sentrifugasi dan inkubasi, anda wajib memberikan sample kepada asisten dan setelah selesai sentrifugasi/ inkubasi asisten yang akan menyerahkan sample ke meja anda masing-masing. 1
Penilaian: - Berhasil menyelesaikan semua tahapan isolasi plasmid. Nilai = 10 - Hasil elektroforesis sampel analisis restriksi. o Plasmid terpotong seluruhnya dan terlihat 2 buah pita (3000 bp dan 750 bp) tampak jelas: 30 poin o Plasmid terpotong hanya sebagian (partial digest): 15 poin o Plasmid tidak terpotong/ tidak ada pita DNA: 0 poin - Kebersihan; peserta yang tidak membuang sampah tips, mikrotube, tissue pada plastik sampah dikenakan pengurangan nilai 10 poin - Peserta yang bersikap tidak wajar dan mengganggu kelancaran tes dikenakan pengurangan nilai 10 hingga sanksi maksimal diskualifikasi. Alat dan Bahan: 1. Endapan bakteri transforman E. coli: 1 tube 2. PD column dan Collection tube @ 1 buah 3. Mikrotube 1,5 ml kosong: 2 buah (1 untuk isolasi plasmid dan 1 untuk analisis restriksi) 4. Buffer isolasi plasmid: PD1 buffer (220 µl), PD2 buffer (220 µl), PD3 buffer (320 µl), Wash buffer (620 µl), Elution buffer/te (60 µl) 5. Analisis restriksi enzim: Enzim EcoRI fast digest (1,5 µl), Buffer FD (1,5 µl), dan Nuclease Free Water/ NFW (10 µl) 6. Mikropipet 100-1000, 10-100, dan 0.5-10 7. Tips (Biru 8 buah, kuning 4 buah, putih 8 buah) 8. Plastik sampah 9. Gabus 10. Tissue 11. Sentrifuga: di meja asisten 12. Penangas 37 0 C dan 80 0 C: di meja asisten Alat dan bahan hanya diberikan sesuai dengan jumlah yang tertera di atas. Peserta tidak diperkenankan meminta tambahan alat maupun bahan kepada asisten. 2
Isolasi Plasmid Protokol: Label No. Meja ditulis dibagian atas mikrotube 3,5 1. Tambahkan 200 µl PD1 buffer ke dalam pelet. Resuspensi sel dengan pipet. 2. Sampel hasil resuspensi, tambahkan 200 µl PD2 buffer. Bolak-balik tabung 10x 3. Setelah sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 2, Tambahkan 300 µl PD3 buffer. Bolak-balik tabung 10x. Serahkan sampel anda ke asisten 4. Asisten: sentrifugasi 14000 rpm, 3. Sampel anda akan dikembalikan oleh asisten berdasarkan No. meja yang tertera di atas tabung mikrotube 5. Letakkan PD column diatas 2 ml collection tube, seperti gambar di bawah ini Label bagian atas PD column dengan No meja anda 1,5 1,5 6. Pindahkan 600 µl supernatan (cairan bening) dari langkah 4 ke dalam PD column. Serahkan sampel anda (PD column dan collection tube) ke asisten. 7. Asisten: sentrifugasi 14000 rpm, 30 detik. Sampel anda akan dikembalikan oleh asisten berdasarkan No. meja yang tertera di atas PD column 8. Buang cairan sisa pada collection tube. Tempatkan kembali PD column pada collection tube 9. Tambahkan 600 µl Wash buffer ke dalam PD column. Serahkan sampel anda (PD column dan collection tube) ke asisten. 10. Asisten: sentrifugasi 14000 rpm, 3. Sampel anda akan dikembalikan oleh asisten berdasarkan No. meja yang tertera di atas PD column 3
11. Buang collecting tube anda beserta cairan sisanya. Tempatkan PD column pada mikrotube kosong seperti gambar di bawah ini. 3 Labeli bagian atas mikrotube dengan No Meja Anda 12. Tambahkan 50 µl elution buffer atau TE di bagian tengah atas matrix PD column 13. Diamkan selama 1, agar larutan TE diserap oleh matrix. Serahkan sampel anda (PD column dan collection tube) ke asisten. 14. Asisten: sentrifugasi 14000 rpm, 2. Sampel plasmid anda diharapkan terelusi dalam 50 µl TE dan terkoleksi pada mikrotube Pekerjaan isolasi DNA plasmid Anda telah selesai. Segera lanjutkan dengan analisis restriksi menggunakan enzim EcoRI mengikuti protokol di halaman berikutnya. 4
Analisis Restriksi Enzim Label sampel ditulis dibagian atas mikrotube 4 1. Lakukanlah konfirmasi hasil isolasi plasmid anda dengan pemotongan plasmid menggunakan enzim restriksi EcoRI, dengan reaksi sebagai berikut : Komponen Konsentrasi Awal Konsentrasi Akhir Volume yang diambil NFW - - (Hingga 10 µl) Buffer FD 10 1 Template DNA - - 3 µl plasmid Enzim EcoRI 10 Unit 1 Unit Total 10 µl Hitunglah volume masing-masing komponen untuk reaksi restriksi diatas dan tuliskan pada kolom yang tersedia. 2. Masukkan seluruh komponen analisis restriksi diatas di dalam mikrotube yang telah disediakan dan campurkan hingga homogen menggunakan mikropipet dan tips. 3. Asisten: Inkubasi selama 5 pada suhu 37 0 C. 4. Asisten: Setelah inkubasi 37 0 C dilakukan, inaktivasi reaksi restriksi pada suhu 80 0 C selama 5. Pekerjaan Anda telah selesai, segera berikan mikrotube berisi hasil restriksi anda kepada asisten. 5