3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Autentikasi Bahan Baku Ikan Tuna (Thunnus sp.) dalam Rangka Peningkatan Keamanan Pangan dengan Metode Berbasis DNA dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan Mei 2010 dan bertempat di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Penelitian Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, dan Laboratorium Penyakit Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah steak ikan tuna (Thunnus obesus, T. alalunga, T. macoyyi, T. albacares) dalam bentuk steak. Produk tuna dalam kaleng berbagai merek yang diperdagangkan di pasar lokal dan swalayan di Bogor. Gambar tuna secara utuh, tuna steak dan contoh tuna kaleng yang digunakan sebagai bahan baku penelitian disajikan pada Gambar 3. Bahan yang digunakan pada preparasi bahan baku antara lain nitrogen cair sedangkan alat yang digunakan adalah talenan, plastik, aluminium foil, kertas label lalu tempat penyimpanan dingin (freezer). Alat yang digunakan pada ekstraksi DNA menggunakan metode CTAB antara lain mortar dan penggerus steril, wadah es batu, ice maker, tabung mikro 1,5 ml, water bath, pipet mikro, pipette tips, sentrifuse, dan vortex. Bahan yang digunakan pada ekstraksi DNA menggunakan metode CTAB adalah ikan tuna (Thunnus sp), es batu, nitrogen cair, larutan Buffer TE, larutan lisis, kloroform, larutan presipitasi, larutan NaCl 1,2 M, etanol dingin, dan Aquabidestilata. Sedangkan alat yang digunakan antara lain tabung mikro 1,5 ml, vortex, water bath, sentrifuse, colum, dan collection tube.
22 a b c d e f Gambar 3 Koleksi sampel penelitian: a. Thunnus albacares, b.thunnus obesus, c. Thunnus maccoyii, d. Thunnus albacares (dalam lingkaran merah), e. Tuna segar dalam bentuk steak yang dikemas dalam wadah vacuum, f. Tuna dalam kaleng Bahan yang digunakan saat PCR adalah es batu, aquabidestilata (ddh 2 O), primer dengan fishcytb-f dengan urutan 5 ACCACCGTTGTTATTCAACTACA AGAAC 3 dan cytb1-5r : 5 GGTCTTTGAAGGAGAAGTATGGGTGGAA 3, DNA hasil ekstraksi, dan larutan mix (PCR kit commercial). Alat yang digunakan pada proses PCR antara lain pipet mikro, wadah es batu, ice maker, pipette tips, marker pen, tabung PCR 50 µl.
Bahan yang digunakan saat elektroforesis adalah bubuk Agarosa dan larutan Buffer TBE 1x. Alat yang digunakan pada elektroforesis antara lain casting tray, pisau bedah, seperangkat alat katoda-anoda, alat sinar UV. Bahan yang digunakan adalah gel agarosa, larutan buffer TBE, loading dye, DNA marker, ethidium bromida dan aquades. Alat yang digunakan pada pembuatan gel agarosa antara lain gelas ukur, labu ukur, timbangan digital, microwave, cetakan agar, electrophoresis comb, dan alumunium foil. Gambar alat dan contoh pembuatan larutan yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada Lampiran 1 dan 2. 3.3 Tahapan Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam lima tahap yaitu: preparasi dan karakterisasi label sampel produk perikanan, penentuan primer oligonukleotida spesifik gen cyt-b tuna, isolasi/ektraksi total genom (DNA), optimasi metode autentikasi label berbasis DNA dengan PCR simpleks, penentuan urutan nukleotida dan penjajaran produk hasil PCR (amplikon) dengan Gene Bank. Adapun diagram alir tahapantahapan pada penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 4. 3.3.1 Koleksi Sampel Ikan tuna (Thunnus sp.) yang digunakan pada penelitian ini berasal dari PT. Lautan Bahari Sejahtera, Muara Baru, Jakarta Utara, PT. Perikanan Nusantara, Benoa, Bali dan pasar swalayan daerah Bogor. Produk tuna dalam kaleng diperoleh dari pasar swalayan di Bogor. 3.3.2 Metode Ekstraksi DNA CTAB Ekstraksi DNA menggunakan CTAB diawali dengan melisis jaringan menggunakan nitrogen cair yang selanjutnya dilakukan penambahan larutan CTAB 500 µl. Sampel yang digunakan sebanyak 0,1-0,5 gram, dan padanya ditambahkan 14 µl proteinase K, diinkubasi pada suhu 55 o C selama dua jam dan disentrifuse selama sepuluh menit pada 13000 rpm (rotation per minute). Sampel yang telah disentrifuse diberi 500 µl PCI, dikocok sekitar lima menit agar larutan tercampur, kemudian disentrifuse selama lima menit pada 13000 rpm.
Larutan PCI kemudian dibuang, ditambah 400 µl kloroform isoamilalkohol dan disentrifuse selama lima menit pada 13000 rpm. Bagian yang mengandung kloroform isoamilalkohol dibuang, ditambah 600 µl isopropanol dan dipresipitasi pada suhu 4 o C selama satu malam, disentrifus selama sepuluh menit pada 13000 rpm. Bagian yang mengandung isopropanol dibuang, ditambah 500 µl etanol 70% kemudian disentrifuse selama sepuluh menit pada 13000 rpm. Bagian yang mengandung etanol dibuang dan selanjutnya dikeringkan kurang lebih selama satu jam, ditambahkan 100 µl Tris EDTA dan disimpan pada suhu 4 o C. Diagram alir proses ekstraksi DNA dengan metode CTAB disajikan pada Lampiran 3. Gambar 4 Diagram alir tahapan penelitian
3.3.3 Elektroforesis Elektroforesis agarose digunakan untuk mengetahui/memastikan adanya DNA setelah proses ekstraksi DNA dan untuk mengidentifikasi keberhasilan proses amplifikasi setelah PCR. Gel agorose dibuat dengan cara mensuspensikan agarose kering di dalam larutan buffer TBE 1X, merebusnya hingga larutan tersebut berwarna jernih, kemudian menuangkannya pada casting tray dan membiarkannya hingga dingin. Selama elektroforesis, gel akan terendam di dalam ruangan yang mengandung larutan buffer serta elektroda positif dan negatif. DNA yang terekstraksi akan dicampur dengan loading dye yang berguna untuk memberi warna, memudahkan pemasukan ke dalam sumur dan menambah densitas DNA. DNA yang akan dianalisis akan berjalan melewati pori-pori pada gel dengan adanya arus listrik. DNA akan bergerak ke kutub positif dan menjauhi kutub negatif karena adanya arus listrik. Gel tersebut kemudian diwarnai dengan larutan ethidium bromida, untuk selanjutnya divisualisasikan dibawah gelombang pendek sinar UV (Basit 2009). 3.3.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) Proses ekstraksi DNA dapat diperjelas/diperkuat dengan menggunakan polymerase chain reaction (PCR). Campuran utama pada reaksi ini terdiri dari air, buffer, dntps, primer dan Taq DNA polymerase yang telah disiapkan dalam suatu tabung, kemudian dialiquoted ke dalam tabung-tabung. Setelah itu MgCl 2 dan larutan DNA template ditambahkan (Basit 2009). Bahan-bahan tersebut telah dicampurkan dalam produk PCR mix komersial dengan merek dagang Vivantis. Sampel DNA yang telah diekstraksi (3.3.2) dipersiapkan untuk PCR sebanyak 2 µl. Bahan untuk PCR adalah 7,5 µl ddh 2 O, primer fishcytb-f dan cytb1-5r masing-masing 1,5 µl, PCR mix yang mengandung Taq polimerase dan dntp dicampur dalam tabung PCR. Aquabidestilata (ddh 2 O) berfungsi untuk melarutkan komponen PCR agar bercampur setelah itu primer baik forward maupun reverse yang berfungsi untuk proses penggandaan pada PCR, primer yang telah dimasukkan dalam tabung PCR kemudian ditambahkan DNA sebanyak 2 µl dan yang terakhir adalah PCR mix, yang terdiri dari dntp yang berfungsi agar pada proses PCR dapat membuat untai baru serta Taq polimerase.
Komponen yang berada pada tabung PCR dimasukkan ke thermocycler yang sebelumnya harus diatur suhu dan siklus yang akan digunakan. Siklus PCR secara garis besar dibagi menjadi lima bagian mulai dari pre-denaturation, denaturation, annealing, extension, post-extension dan preservation yang ilustrasinya disajikan pada Gambar 5. Produk PCR kemudian dapat divisualisasikan pada 1% dan 2,5% gel agarose yang telah diberi pewarna berupa larutan ethidium bromide untuk dielektroforesis, kemudian divisualisasikan di bawah gelombang pendek sinar UV. Gambar 5 Siklus PCR 3.3.5 Penentuan Urutan Nukleotida dan Penjajaran DNA Penentuan urutan nukleotida dilakukan dengan cara mengirimkan sampel ke Macrogen Inc., Korea Selatan. Data urutan nukleotida yang diperoleh kemudian disejajarkan dengan Gene Bank menggunakan software Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) untuk mendapatkan nama spesies tuna sebagai bahan baku produk tuna kaleng.