BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Alat Alat elektroforesis agarosa (Biorad), autoklaf, cawan Petri, GeneAid High Speed Plasmid Mini kit, inkubator goyang (GSL), jarum Ose bundar, kit GFX (GE Healthcare), kompor listrik (Rommelsbacher), laminar air flow Cabinet (Microflow), lampu spiritus, lemari pendingin -20ºC (Denpoo), Thermal Cycler (2720 Applied Biosystems), mikropipet (Eppendorf), oven (LTE, Ltd), program DNAWorks ver2.4 dan VectorNTi, sentrifuga (Mikro200R zentrifugen Hettich), tip, transluminator ultraviolet (Vilber lourmat), tabung Eppendorf 1.5mL, tabung PCR 200 μl, tusuk gigi, dan alat Vortex. 3.2 Bahan Agarosa (MD Bio), ampisilin, Bakto Tripton (Difco), Baktoagar (Conda), bromfenol biru, Bovine Serum Albumin (BSA), buffer E, buffer Pfu 10x, buffer TAE, buffer Taq 10x, dimetil formamida (DMF), dntp, enzim restriksi EcoRI (Roche) dan HindIII (Promega), enzim polimerase Taq (MD Bio), Escherichia coli JM109, etidium bromida (EtBr), etilen diamin tetraasetat (EDTA), gliserol, High Fidelity DNA Polymerase (Pfu), isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), kalium klorida (KCl), kalsium klorida (CaCl 2), loading buffer, marka DNA 100 pb dan 1 Kilo basa(kb) (MD Bio), media Luria Bertani (LB) cair dan padat, magnesium klorida (MgCl 2 ), miliq water, natrium klorida (NaCl), oligonukleotida (Biolabs), sodium dodecyl sulphate (SDS), sukrosa, T4 DNA ligase, vektor kloning pgem-t (Promega), X-Gal, dan ekstrak ragi (Difco). 15
16 3.3 Perancangan dan Sintesis Oligonukleotida Sintetik Daerah Pengkode IFNα2b Sintetis Perancangan 10 oligonukleotida untuk kedua rantai dengan panjang 61-74 pb dan memiliki daerah tumpang tindih sebanyak 18-26 nukleotida dengan suhu penempelan (Tm) sebesar 60,35±2,11 ºC menggunakan program DNAWorks ver2.4 dan VectorNTi. Perancangan dua primer pendek untuk amplifikasi daerah pengkode IFNα2b menggunakan program komputer VectorNTi. Keseluruhan oligonukleotida disintesis dan dimurnikan secara komersial oleh Biolabs. 3.4 Sintesis dan Amplifikasi Daerah Pengkode IFNα2b Sintetis Sintesis dan amplifikasi dilakukan menggunakan metode PCR dua tahap, dimana pada PCR tahap I menggunakan metode berbasis sintesis dua arah TBIO untuk sintesis daerah pengkode IFNα2b sintetis yang dilanjutkan dengan PCR tahap kedua untuk amplifikasi daerah pengkode IFNα2b sintetis. PCR tahap I menggunakan DNA polimerase Pfu, sedangkan PCR tahap kedua menggunakan DNA polimerase Taq. PCR tahap I dilakukan secara Hot Start yang terdiri atas tahap pradenaturasi awal pada suhu 95ºC selama 2 menit, denaturasi pada suhu 95ºC selama 30 detik, penempelan pada suhu 54ºC selama 45 detik dan pemanjangan pada suhu 72ºC selama 1 menit sebanyak 25 siklus dan diakhiri dengan 72ºC selama 10 menit. PCR tahap kedua terdiri atas tahap pradenaturasi awal pada suhu 94ºC selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94ºC selama 1 menit, penempelan pada suhu 50ºC selama 1 menit, pemanjangan pada suhu 72ºC selama 1 menit sebanyak 25 siklus diakhiri dengan 72ºC selama 10 menit.
17 3.5 Karakterisasi Produk PCR menggunakan Elektroforesis Agarosa Sebanyak 10 μl produk PCR dicampur dengan 2 μl loading buffer dielektroforesis menggunakan gel agarose 2% (b/v) dengan tegangan 70 Volt selama kurang lebih 1 jam dan menggunakan marka DNA 100 pb. Elektroforesis dilakukan sampai loading buffer mencapai dua pertiga dari panjang gel. Setelah elektroforesis selesai, gel direndam dalam etidium bromida (EtBr) selama 30 detik, serta direndam dalam aquades selama 15 menit dan kemudian diamati di bawah sinar UV. 3.6 Purifikasi Daerah Pengkode IFNα2b Sintetik Produk PCR setelah dielektroforesis dipurifikasi menggunakan kit GFX. Pita pada gel dengan ukuran yang diinginkan dipotong menggunakan silet bersih kemudian ditimbang beratnya di dalam tabung Eppendorf yang telah terlebih dahulu ditimbang beratnya dalam keadaan kosong. Buffer pengikat sebanyak 10 μl untuk 10 mg gel ditambahkan ke dalam tabung Eppendorf berisi potongan gel dan diinkubasi pada suhu 50ºC selama 15 menit sampai gel mencair. Setelah inkubasi selesai, sampel dipindahkan ke dalam kolom GFX dan diinkubasi pada suhu kamar selama 1 menit. Tabung berisi sampel disentrifuga dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit. Cairan yang ada di dalam tabung pengumpul dibuang dan kolom GFX dimasukkan kembali ke dalam tabung pengumpul. Buffer pencuci sebanyak 500 μl ditambahkan ke dalam kolom GFX dan disentrifuga kembali (13.000 rpm) selama 1 menit. Cairan pada tabung pengumpul dibuang kembali dan kolom GFX dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf steril kosong. Buffer pengelusi sebanyak 50 μl ditambahkan ke dalam kolom GFX dan disentrifuga (13.000 rpm, 25ºC) untuk mengelusi DNA.
18 Hasil purifikasi kemudian dielektroforesis lagi menggunakan gel agarosa 2% (b/v) dengan tegangan 70 Volt selama 1 jam dengan menggunakan marka DNA 100 pb. Setelah itu gel direndam dalam EtBr dan kemudian diamati di bawah sinar UV. 3.7 Penentuan Urutan Nukleotida dan Ligasi Produk PCR Hasil Purifikasi Penentuan urutan nukleotida dilakukan di Korea (Macrogen). Sampel yang dikirim berupa produk PCR hasil purifikasi sebanyak 1,5 μg, primer forward dan reverse masing-masing 5 μl dengan konsentrasi 10 pmol/3 μl. Daerah pengkode IFNα2b sintetis yang telah ditentukan urutan nukleotidanya kemudian diligasikan dengan vektor kloning pgem-t menggunakan T4 DNA ligase. Komposisi vektor : produk PCR yang digunakan adalah 1:3 dengan total volume 15 μl. Reaksi ligasi diinkubasi pada suhu 4ºC selama 1-2 hari. 3.8 Pembuatan Sel Kompeten Escherichia coli JM109 Koloni E. coli JM109 dari pelat agar dibuat kultur semalam dalam media LB cair dengan kondisi inkubasi 37ºC, 150 rpm. Sebanyak 1 ml kultur E. coli JM109 ini kemudian dipindahkan ke dalam 9 ml media LB cair segar dan diinkubasi kembali (37ºC, 150 rpm) selama 2-3 jam. Setelah inkubasi, kultur sebanyak 1-1,5 ml dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf sebanyak yang dibutuhkan, kemudian didiamkan selama 10 menit di dalam es. Tabung Eppendorf berisi E. coli JM109 kemudian disentrifuga dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit untuk menghasilkan pelet sel. Supernatan dibuang, dan pelet diresuspensi kembali dengan CaCl 2 0,1 M sebanyak 0,5 ml dan didiamkan kembali di dalam es selama 10 menit. Suspensi E. coli JM109 dalam CaCl 2 kemudian disentrifuga kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Pelet sel diresuspensi kembali dengan CaCl 2 dingin sebanyak 50 μl. Sel kompeten diinkubasi di dalam lemari es bersuhu 4ºC selama satu malam.
19 3.9 Transformasi Hasil Ligasi ke dalam E. coli JM109 Hasil ligasi sebanyak 2,5 μl ditambahkan ke dalam tabung Eppendorf berisi 200 μl sel kompeten E. coli JM109. Tabung dibolak-balikkan secara perlahan dan didiamkan di dalam es selama 20 menit. Setelah itu dilakukan proses induksi panas dengan cara menginkubasi tabung berisi sel dan hasil ligasi pada suhu 42ºC selama 45-50 detik dan kemudian langsung diinkubasi di es selama 2 menit. Media LB cair segar sebanyak 950 μl ditambahkan ke dalam tabung dan diinkubasi (37ºC,150rpm) selama 1,5 jam. Sebanyak 50 μl sel transforman diinokulasi dengan metode sebar ke permukaan pelat agar LB yang mengandung ampisilin, IPTG, dan X-Gal. Pelat dibalik dan diinkubasi selama 1 malam pada suhu 37ºC. 3.10 Seleksi dan Karakterisasi Klon Rekombinan Pelat yang sudah diinkubasi diamati kemungkinan adanya koloni baik yang berwarna putih atau biru. Plasmid -baik tanpa DNA sisipan ataupun dengan DNA sisipan- diisolasi dari koloni putih menggunakan GeneAid High Speed Plasmid Mini Kit. Kultur E. coli JM109 yang mengandung plasmid dipeletkan dengan cara disentrifuga (13.000 rpm, 25ºC) selama 1 menit. Pelet sel diresuspensi dengan 200 μl buffer PD1 dan kemudian ditambahkan buffer PD2 sebanyak 200 μl untuk melisiskan sel. Pencampuran dilakukan dengan cara membolak-balikkan tabung sebanyak 10 kali, kemudian diinkubasi selama 2 menit pada suhu kamar sampai terbentuk cairan jernih. Buffer PD3 sebanyak 300 μl ditambahkan untuk menetralkan reaksi lisis sel. Campuran disentrifuga selama 3 menit (13.000 rpm, 25ºC). Supernatan dipindahkan secara hati-hati ke dalam kolom PD beserta tabung pengumpulnya dan disentrifuga selama 30 detik (13.000 rpm). Cairan pada tabung pengumpul dibuang, kemudian sebanyak 400 μl buffer
20 W1 ditambahkan ke dalam kolom serta disentrifuga selama 3 detik (13.000 rpm). Cairan pada tabung pengumpul dibuang dan 600 μl buffer pencuci dimasukkan dalam kolom dan disentrifuga selama 3 menit (13.000 rpm). Kolom dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf kosong steril. Buffer pengelusi sebanyak 50 μl dimasukkan ke dalam kolom dan disentrifuga selama 2 menit (13.000 rpm) agar DNA terelusi dari kolom. Plasmid yang sudah diisolasi kemudian dilakukan analisis migrasi. Analisis migrasi plasmid dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) dengan tegangan 70 Volt sampai loading buffer mencapai dua pertiga dari panjang gel. Gel kemudian direndam di dalam larutan EtBr dan kemudian diamati dengan sinar UV. Plasmid dengan migrasi yang lebih lambat kemudian dilakukan analisis restriksi baik menggunakan satu jenis enzim maupun dua jenis enzim sekaligus untuk memperkirakan panjang DNA sisipan menggunakan enzim restriksi EcoRI dan HindIII. Komposisi reaksi antara jumlah plasmid dengan enzim adalah 5-10:1. Reaksi digesti dengan enzim diinkubasi pada suhu 37ºC selama satu jam. Hasil pemotongan dengan enzim dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v). Gel kemudian direndam dalam EtBr dan hasilnya diamati di bawah sinar UV. Setelah dilakukan analisis restriksi, dilakukan analisis PCR dengan kondisi yang sama dengan kondisi untuk PCR tahap kedua. Penentuan urutan nukleotida dilakukan di Korea (Macrogen). Sampel yang dikirim berupa plasmid pgem-t rekombinan hasil isolasi sebanyak 3 μg, primer forward dan primer reverse sebanyak 5 μl dengan konsentrasi 10 pmol/3 μl.