21 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif kuantitatif untuk mengekstraksi DNA dari dari beberapa spesimen herbarium Rafflesia arnoldii R.Br dan Rafflesia patma Blume. Spesimen disajikan pada tabel (3.1). Dalam penelitian ini akan dibandingkan empat protokol yaitu: Kit Promega, Kit Plant DNA Mini, CTAB, Doyle and Doyle, (1990) dan CTAB, Cota Shanchez et. al.,(2006). Tabel 3.1. Keterangan Spesimen Herbarium Rafflesia Kode Keterangan Sumber bahan Lama koleksi Sifat jaringan BrRp Braktea Rafflesia patma 5 tahun jaringan tua yang kering Blume. BrRa Braktea R. 10 tahun jaringan muda arnoldii R.Br. PeRa CaRa Perigon R. arnoldii R.Br. Cakram R.arnoldii R.Br. 3.2 Waktu dan Tempat Penelitian Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor - LIPI) Koleksi Laboratorium Jurusan Kehutanan - Universitas Bengkulu Koleksi Laboratorium Jurusan Kehutanan - Universitas Bengkulu Koleksi Laboratorium Jurusan Kehutanan - Universitas Bengkulu 10 tahun 10 tahun jaringan muda jaringan muda Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2012 - Maret 2013 di Laboratorium Riset Genetika dan Biologi Molekular Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang. 21
22 3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat-alat Alat-alat yang dibutuhkan pada penelitian ini adalah: tabung mikrosentrifuse steril spesifikasi 1,5 ml dan 2 ml; mesin sentrifus; water bath; vortex; rak tabung; wadah limbah cair; mikropipet skala 0,5 µl 1000 µl; hand glove dan alat sterilisasi; mortal dan pistil; horizontal agarose gel electroforesis apparatus; power supply; cetakan gel dan sisir pembentuk sumur; hot plate; UV transiluminator beserta kamera Polaroid; nanospetrofotometer 2000; blue, yellow, white tip; inkubator; frezer -20 o C dan -72 o C dan kipas. 3.3.2 Bahan-bahan Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam penelitian adalah Kit Promega (Protokol I); Kit Plant Mini (Protokol II); Protokol III dan protokol IV ini disajikan dalam tabel berikut: Tabel 3.2 Bahan-bahan Penelitian Protokol III Nitrogen cair Sampel dari spesimen herbarium Buffer ekstraksi - 2% CTAB - 100 mm Tris-HCl ph 7,5-1,4 M NaCl - 20mM ethylen diamine tetraacetic acid (EDTA) ph 8,0-2% β-mercaptoetanol - 2% PVP-40 Chloroform:isoamyl alcohol (CIA) 24:1 Isopropanol 70 % Etanol TE-Rnase solution - 1 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8,0, 10mg/mL RNase Protokol IV Nitrogen cair Sampel dari spesimen herbarium Buffer ekstraksi - 2% CTAB - 100 mm Tris-HCl ph 7,5-1,4 M NaCl - 20mM EDTA ph 8,0-2% β-mercaptoetanol Chloroform:isoamyl alcohol (CIA) 24:1 Isopropanol dingin 70 % Etanol TE-Rnase solution 1 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8,0, 10mg/mL RNase
23 3.4 Langkah Kerja 3.4.1 Protokol I (Kit Promega) Langkah kerja Isolasi DNA spesimen herbarium Rafflesia menggunkan Kit Promega megikuti pedoman yang tertera pada produk. Langkah kerja Kit Promega adalah sebagai berikut: - Sampel digerus menggunakan nitrogen cair hingga menjadi serbuk. - Sebanyak 40 mg serbuk dimasukkan ke dalam 1,5mL tabung. - 600µL Nuclei Lysis Solution ditambahkan ke dalam taabung. - Tabung di-vortek selama 3 detik. - 3µL Rnase solution ditambahkan ke dalam sampel. - Campuran diinkubasi pada suhu 37 o C selama 15 menit. - Campuran didinginkan hingga menjadi suhu ruangan selama 5 menit. - 200µL Protein Precipitation Solution ditambahkan ke dalam tabung. - Tabung di-vortek dengan cepat selama 20 detik. - Tabung disentrifus selama 3 menit pada 13.000 x g. - Supernatan dipindahkan secara hati-hati ke dalam 1,5 ml tabung yang berisi 600µL isopropanol bersuhu ruangan. - Campuran dibolak-balik dengan pelan. - Tabung disentrifus selama 1 menit pada 13.000 x g. - Supernatan dibuang. - 600 µl etanol 70% bersuhu ruangan ditambahkan ke dalam tabung. - Tabung di-invertagar dapat mencuci DNA. - Tabung disentrifus selama 1 menit pada 13.000 x g suhu ruangan.
24 - Diuapkan etanol hingga tersisa pelet. - 100µL DNA Rehydration dimasukkan ke dalam tabung. - Isolat DNA diinkubasi selama 1 jam pada suhu 65 o C. 3.4.2 Protokol II (Kit Plant DNA Mini) Langkah kerja Isolasi DNA dari spesimen herbarium Rafflesia menggunkan Kit Plant DNA Mini megikuti pedoman yang tertera pada produklangkah kerja Kit Promega adalah sebagai berikut: - Sampel digerus menggunakan nitrogen cair hingga menjadi serbuk. - 50mg serbuk dimasukkan ke dalam tabung 2mL. - 800 µl P1 Buffer ditambahkan ke dalam tabung. - Campuran divortek. - Campuran diinkubasi pada suhu 65 o C selam 10 menit sambil dibolak-balik tabungnya. - 140 µl P2 Buffer ditambahkan ke dalam tabung. - Tabung divortek. - Tabung disentrifus selama 10 menit pada 10.000 x g. - Supernatan dipindahkan ke tub baru yang berisi 0,7 volume isopropanol. - Tabung divortek. - Tabung disentrifus selama 2 menit pada 14.000 x g. - Supernatan dibuang dengan hati-hati agar tidak mengenai pelet. - 300 µl steril de-ionized water bersuhu 65 o C ditambahkan ke dalam tabung. - 4 µl Rnase A ditambahkan.
25-150µL P3 buffer dan 300 µl etanol absolut ditambahkan ke dalam tabung. - Tabung divortek - Campuran dimasukkan ke dalam tabung 2 ml yang dilengkapi HiBind. - Tabung disentrifus selama 1 menit pada 10. 000 x g. - HiBind DNA Coloum ditempatkan pada tabung baru. - 650 µl DNA Wash Buffer ditambahkan ke dalam tabung. - Tabung disentrifus selama 1 menit pada 10.000 x g. - HiBind DNA Coloumn yang kosong disentrifuse selama 2 menit pada 10.000 x g. - Dipindahkan HiBind DNA Coloumn ke tabung 1,5 ml yan baru. - Ditambahkan 50 µl Elution Buffer bersuhu 65 o C ke dalam HiBind. 3.4.3 Protokol III (metode Doyle and Doyle, 1990) Langkah kerja Isolasi DNA dari spesimen herbarium Rafflesia menggunakan protokol III adalah sebagai berikut: - Sampel digerus menggunakan nitrogen cair hingga menjadi serbuk. - 0,1 g serbuk dimasukkan ke dalam tabung2ml. - 1 ml buffer ekstraksi ditambahkan ke dalam tabung. - Campuran diinkubasi pada suhu 60 o C selama 60 menit (sampel di-invert setiap 5 menit). - Campuran didinginkan pada suhu ruang. - Campuran ditambahkan 600 µlcia. - Campuran dikocok dengan pelan selama 5 menit. - Tabung disentrifus pada 10,000 rpm selama 15 menit.
26 - Supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru. - Isopropanol ditambahkan ke dalam supernatan dengan volume yang sama. - Campuran dikocok dengan pelan. - Campuran diinkubasi pada -20 o C selama 27 jam. - Campuran disentrifus pada 10,000 rpm selama 15 menit. - Supernatan dibuang. - Pelet dicuci dengan etanol 70%. - Tabung disentrifus pada 13,000 rpm selama 10 menit. - DNA dikeringkan. - Pelet dicuci dengan etanol 70%. - Tabung disentrifus pada 13,000 rpm selama 10 menit. - DNA dikeringkan. - Pelet dilarutkan dalam 40µL TE-Rnase. - Tabung diinkubasi selama 1 jam pada 37 o C. 3.4.4 Protokol IV (metode Cota-Sanchez et al., 2006) Langkah kerja Isolasi DNA dari spesimen herbarium Rafflesia menggunakan protokol IV adalah sebagai berikut: - Sampel digerus menggunakan nitrogen cair hingga menjadi serbuk. - 0,1 g sampeldimasukkan ke dalam tabung 2mL. - 800 µl buffer ekstraksi suhu 65 o C ditambahkan ke dalam tabung. - Campuran diinkubasi pada suhu 65 o C dalam water bath selama 15 menit (di-invertsampel setiap 5 menit). - Campurandindingkan hingga menjadi suhu ruang.
27-750 µlcia ditambahakan ke dalam tabung. - Tabung di-invert dengan pelan sebanyak 50 kali. - Tabung disentrifus pada 10,000 rpm selama 15 menit. - Supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru. - Tabung di-invert dengan pelan sebanyak 50 kali. - Tabung disentrifus pada 10,000 rpm selama 15 menit. - Supernatan dimasukkan dalam tub baru yang berisi 0,7 volume isopropanol dingin. - Campuran disentrifus pada 10,000 rpm selama 15 menit. - Supernatan dibuang. - Pelet dicuci dengan 1 ml etanol 70%. - Tabung disentrifus pada 10,000 rpm selama 10 menit. - DNA dikeringkan. - Pelet dilarutkan dalam 40µL TE-Rnase. - Tabung diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit. 3.5 Uji Hasil Ekstraksi DNA Uji hasil isolasi DNA dilakukan secara kuantitatif dan kualitatif. DNA total hasil isolasi kemudian diuji kuantitatif untuk mengetahui kosentrasinya dengan mengukur perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kosentrasi DNA yang tinggi digambarkan dengan nilai serapan tinggi pada panjang gelombang 260 nm. kemurnian DNA dibanding dengan makromolekul lain dapat dilihat dari perbandingan serapan anatara 260/280 yang berkisar antara 1,8-2,0 (Sambrook et al. 1989). Uji kualitatis DNA dilakukan
28 dengan teknik elektroforesis gel agarose 2% pada tegangan 85V, 90 menit menggunakan 1X buffer TBE. Pada masing masing sumur dimasukan 4 µl DNA masing-masing sampel, 6 µl aquades dan 2 µl loading dye.