BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tuberkulosis Tuberkulosis, singkatnya TB, adalah suatu penyakit menular yang paling sering (sekitar 80%) terjadi di paru-paru. Penyebabnya adalah suatu basil Grampositif tahan-asam dengan pertumbuhan sangat lamban, yakni Mycobacterium tuberculosis (Tjay dan Rahardja, 2002). Umumnya Mycobacterium tuberculosis menyerang paru dan sebagian kecil organ tubuh lain. Kuman ini mempunyai sifat khusus, yakni tahan terhadap asam pada pewarnaan, hal ini dipakai untuk identifikasi dahak secara mikroskopis, sehingga disebut sebagai Basil Tahan Asam (BTA). Mycobacterium tuberculosis cepat mati dengan matahari langsung, tetapi dapat bertahan hidup pada tempat yang gelap dan lembab. Dalam jaringan tubuh, kuman dapat dormant (tertidur sampai beberapa tahun) (Depkes RI, 2005). Gejala TB antara lain batuk kronik, demam, berkeringat waktu malam, keluhan pernapasan, perasaan letih, malaise, hilang nafsu makan, turunnya berat badan, dan rasa nyeri di bagian dada. Dahak penderita berupa lendir (mucoid), purulent, atau mengandung darah (Tjay dan Rahardja, 2002). Penularan TB sangat dipengaruhi oleh masalah lingkungan, perilaku sehat penduduk, ketersediaan sarana pelayanan kesehatan. Masalah lingkungan yang terkait seperti masalah kesehatan yang berhubungan dengan perumahan, kapadatan anggota keluarga,kepadatan penduduk, konsentrasi kuman, ketersediaan cahaya matahari, dll. Sedangkan masalah perilaku sehat antara lain akibat dari meludah sembarangan, batuk sembarangan, kedekatan anggota
keluarga, gizi yang kurang atau tidak seimbang, dll. Untuk sarana pelayanan kesehatan, antara lain menyangkut ketersediaan obat, penyuluhan tentang penyakit dan mutu pelayanan kesehatan (Depkes RI, 2005). Pengobatan infeksi kuman tahan asam masih merupakan persoalan dan tantangan dalam bidang kemoterapi. Menurut Zubaidi (1995), faktor yang mempersulit pengobatan ialah : 1. Kurangnya daya tahan hospes terhadap mikobakteria 2. Kurangnya daya bakterisid obat yang ada 3. Timbulnya resistensi kuman terhadap obat, dan 4. Masalah efek samping obat. Obat Anti Tuberkulosis (OAT) yang sering digunakan dewasa ini adalah Isoniazid, Rifampisin, Pirazinamid, dan Etambutol. Semua obat ini bersifat bakterisid, kecuali Etambutol yang bersifat bakteriostatik (Suryatenggara, 1990). 2.2 Isoniazid (Ditjen POM, 1979) Piridina-4-karboksil-hidrazida Pemerian : hablur tidak berwarna atau serbuk hablur putih; tidak berbau; rasa agak pahit; terurai perlahan-lahan oleh udara dan cahaya. Kelarutan : mudah larut dalam air; agak sukar larut dalam etanol (95%) P sukar larut dalam kloroform P dan dalam eter P.
Rumus Molekul (RM) : C 6 H 7 N 3 O Bobot Molekul (BM) : 137,14 2.3 Farmakokinetika Isoniazid Derivat asam isonikotinat ini berkhasiat tuberkulostatis paling kuat terhadap Mikobakterium tuberkulosis (dalam fase istirahat) dan bersifat bakterisid terhadap basil yang sedang tumbuh pesat. Isoniazid masih tetap merupakan obat kemoterapi terpenting terhadap berbagai tipe tuberkulosa dan selalu dalam bentuk multipel terapi dengan rifampisin dan pirazinamida (Tjay dan Rahardja, 2002). Isoniazid langsung diserap dari saluran cerna. Pemberian dosis oral sebesar 300 mg (5 mg/kg untuk anak-anak) menghasilkan konsentrasi plasma puncak 3-5 µg/ml dalam 1-2 jam. Isoniazid langsung berdifusi secara cepat dalam darah ke seluruh cairan tubuh dan jaringan (Chambers, 2004). Mekanisme kerja isoniazid memiliki efek pada lemak, biosintesis asam nukleat,dan glikolisis. Efek utamanya ialah menghambat biosintesis asam mikolat (mycolic acid) yang merupakan unsur penting dinding sel mikobakterium (Tjay dan Rahardja, 2002). Efek sampingnya pada dosis normal (200-300 mg sehari) jarang dan ringan (gatal-gatal, ikterus), tetapi lebih sering terjadi bila dosis melebihi 400 mg. Yang terpenting adalah polineuritis, yakni radang saraf dengan gejala kejang dan gangguan penglihatan. Penyebabnya adalah persaingan dengan piridoksin yang rumus kimianya mirip INH. Perasaan tidak sehat, letih dan lemah, serta anoreksia adalah lazim pula. Guna menghindari reaksi toksis ini biasanya diberikan vitamin
B 6 (piridoksin) 10-20 mg sehari bersama vitamin B 1 (aneurin) 100 mg (Tjay dan Rahardja, 2002). Resistensi dapat timbul agak cepat bila digunakan sebagai obat tunggal, tetapi resistensi silang dengan obat-obat TBC lainnya tidak terjadi (Tjay dan Rahardja, 2002). Pengobatan dengan OAT dulu biasanya hanya berupa pemberian obat tunggal dan hanya dalam waktu yang singkat. Hasilnya ternyata kurang memuaskan karena banyak dijumpai kekambuhan disebabkan masalah resistensi. Muncul pemikiran untuk memperpanjang waktu pengobatan untuk mengurangi kekambuhan serta menggunakan kombinasi obat untuk mencegah timbulnya resistensi (Zubaidi, 1995). 2.4 Monitoring Kadar Terapeutik Obat Yang dimaksud dengan monitoring kadar terapeutik obat adalah pemeriksaan secara berkala kadar obat dalam darah guna membantu klinisi dalam menentukan dosis obat yang dapat menyembuhkan atau mengobati penyakit penderita (Muchtar, 1985). Pemantauan konsentrasi obat dalam darah atau plasma meyakinkan bahwa dosis yang telah diperhitungkan benar-benar telah melepaskan obat dalam plasma dalam kadar yang diperlukan untuk efek terapetik. Untuk beberapa obat, kepekaan reseptor pada individu berbeda, sehingga pemantauan kadar obat dalam plasma diperlukan untuk membedakan penderita yang menerima terlalu banyak obat dan penderita yang sangat peka terhadap obat. Dengan demikian pemantauan terapi
konsentrasi obat dalam plasma memungkinkan untuk penyesuaian dosis obat secara individual dan juga untuk mengoptimasi terapi (Shargel, 1988). Dalam pemberian obat-obat yang poten kepada penderita, sudah seharusnya mempertahankan kadar obat dalam plasma berada dalam batas yang dekat dengan konsentrasi terapetik. Karena perbedaan antar penderita dalam hal absorpsi, distribusi dan eliminasi obat maupun perubahan kondisi patofisioliogik penderita, maka dalam beberapa rumah sakit telah ditetapkan adanya pelayanan pemantauan terapetik obat atau Therapeutic Drug Monitoring (TDM) untuk menilai respon penderita terhadap aturan dosis yang dianjurkan (Shargel, 1988). Menurut Shargel (1988), fungsi dari pelayanan TDM yaitu: 1. Memilih obat 2. Merancang aturan dosis 3. Menilai respons penderita 4. Menentukan perlunya pengukuran konsentrasi obat dalam serum 5. Menetapkan kadar obat 6. Melakukan penilaian secara farmakokinetik kadar obat 7. Menyesuaikan kembali aturan dosis 8. Memantau konsentrasi obat dalam serum 9. Menganjurkan adanya persyaratan khusus. Tujuan dari proses pemantauan terapi obat adalah menyesuaikan terapi obat pada karakteristik pasien individu, memaksimalkan manfaat dan meminimalkan resiko. Respon terhadap terapi obat adalah suatu fenomena yang kompleks dan dipengaruhi oleh obat yang digunakan pasien yang diterimanya dari dokter yang menulisnya. Berbagai sifat farmakokinetik seperti absorbsi, distribusi,
metabolisme, ekskresi dan durasi kerja harus dipertimbangkan apabila mendesain suatu regimen obat. (Siregar dan Endang, 2004). 2.5 Plasma dan Darah Darah lengkap berisi unsur-unsur seluler yang terdiri dari sel darah merah, sel darah putih, platelet, dan berbagai macam protein lain seperti albumin dan globulin. Secara umum, serum atau plasma digunakan untuk pengukuran obat. Perbedaan serum dan plasma yaitu: Untuk memperoleh serum, darah dibiarkan menggumpal kemudian disentrifugasi. Supernatan yang diperoleh setelah disentrifugasi itulah yang disebut serum. Serum tdak mengandung fibrinogen. Sedangkan plasma diperoleh dari darah yang telah ditambahkan antikoagulan seperti heparin, kemudian disentrifugasi, supernatannya inilah yang disebut plasma (Shargel, 1941). Darah yang dikumpulkan dan dicegah dari pembekuan dengan menambahkan antikoagulan (heparin, sitrat dan sebagainya), bila disentrifugasi akan terpisah, menjadi lapisan-lapisan yang menggambarkan heterogenitasnya. Hasil yang diperoleh dengan sedimentasi ini, yang dilakukan dalam tabung gelas standar adalah hematokrit. Cairan translusen, kekuningan dan sedikit kental yang terletak di atas bila hematokrit diukur adalah plasma darah. Lapisan tepat di atasnya (1% volume darah) yang berwarna putih atau kelabu dinamakan buffy coat dan terdiri atas leukosit. Plasma darah merupakan bagian cair darah. Cairan ini didapat dengan membuat darah tidak beku dan sel darah tersentrifugasi. Plasma terdiri dari 90% air, 7-8% protein, dan di dalam plasma terkandung
beberapa komponen lain seperti garam-garam, karbohidrat, lipid, dan asam amino (Junqueira dan Carneiro, 1982). Plasma Buffy coat Sel darah merah Anonim b (2008). 2.6 Kromatografi Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fase yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fase diam, dapat berupa zat cair atau zat padat (Edward dan Stevenson, 1991). 2.6.1 Pembagian Kromatografi Menurut Rohman (2007), kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung pada pengelompokannya yaitu berdasarkan pada alat yang digunakan dan berdasarkan pada mekanisme pemisahannya. Berdasarkan alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: a) Kromatografi kertas b) Kromatografi lapis tipis c) Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) d) Kromatografi gas Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi : a) Kromatografi adsorbsi
b) Kromatografi partisi c) Kromatografi pasangan ion d) Kromatografi penukar ion e) Kromatografi eksklusi ukuran, dan f) Kromatografi afinitas 2.6.2 Penggunaan Kromatografi Menurut Gritter (1991), penggunaan kromatografi antara lain yaitu: 1. Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya senyawa tertentu dalam cuplikan 2. Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing komponen campuran 3. Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran dalam jumlah memadai dalam keadaan murni. 2.6.3 Profil Puncak dan Pelebaran Puncak Selama pemisahan kromatografi, solut individual akan membentuk profil konsentrasi yang simetris atau dikenal juga dengan profil Gaussian dalam arah aliran fase gerak. Profil dikenal juga dengan punak atau pita, secara perlahanlahan akan melebar dan sering juga membentuk profil yang asimetrik karena solut solut melanjutkan migrasinya ke fase diam (Rohman, 2007) Ada 2 jenis puncak asimetris yakni membentuk puncak yang berekor (tailing) dan adanya puncak pendahulu (fronting) jika ada perubahan rasio distribusi solut yang lebih besar (Rohman, 2007).
Baik tailing maupun fronting tidak dikehendaki karena dapat menyebabkan pemisahan kurang baik dan data retensi kurang reprodusibel. Menurut Rohman (2007), adanya puncak yang asimetri dapat disebabkan oleh halhal berikut: a) Ukuran sampel yang dianalisis terlalu besar. Jika sampel terlalu besar maka fase gerak tidak mampu membawa solute dengan sempurna karenanya akan terjadi pengekoran atau tailing. b) Interaksi yang kuat antara solute dengan fase diam dapat menyebabkan solute sukar terelusi sehingga dapat menyebabkan terbentuknya puncak yang mengekor. c) Adanya kontaminan dalam sampel yang dapat muncul terlebih dahulu sehingga menimbulkan puncak mendahului (fronting). Untuk menentukan tingkat asimetri puncak dilakukan dengan menghitung faktor asimetris atau disebut juga dengan tailing factor (TF) yang dinyatakan dengan rasio antara lebar setengah tinggi puncak. Kromatogram yang memberikan harga TF=1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat setangkup atau simetris. Harga TF>1 menunjukkan bahwa kromatogram mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar harga TF maka kolom yang dipakai semakin kurang efisien. Dengan demikian harga TF dapat digunakan untuk melihat efisiensi kolom kromatografi (Rohman, 2007). 2.7 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi karena didukung oleh kemajuan dalam
teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam sehingga mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Ditjen POM, 1995). KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain; farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer dan industriindustri makanan (Rohman, 2007). Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawasenyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan proteinprotein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain (Rohman, 2007). Menurut Putra (2007), kelebihan KCKT antara lain: 1. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran 2. Resolusinya baik 3. Mudah melaksanakannya 4. Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi 5. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis 6. Dapat digunakan bermacam-macam detektor 7. Kolom dapat digunakan kembali 8. Mudah melakukan rekoveri cuplikan
9. Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan reprodusibilitasnya lebih baik 10. Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif 11. Waktu analisis umumnya singkat 12. Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar 13. Ideal untuk molekul besar dan ion. 2.7.1 Cara Kerja KCKT Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair secara sukses terhadap suatu masalah yang dihadapi membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel (Rohman, 2007). 2.7.2 Komponen-Komponen Alat KCKT 2.7.2.1 Wadah Fase Gerak Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung tandon harus lebih besar dari 500 ml, yang dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1-2 ml/menit (Putra, 2007).
2.7.2.2 Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan takanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan (Rohman, 2007). 2.7.2.3 Injektor Cuplikan yang akan dianalisis dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum yaitu: Stopped Flow dan Solvent Flowing. Menurut Putra (2007) ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan yaitu: a. Hentikan aliran/stop flow: aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi. b. Septum: injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Disamping itu,
partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. c. Katup putaran (loop valve): tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari pada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara automatis (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom. Gambar 3. Tipe injektor katup putara 2.7.2.4 Kolom Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Menurut Edward dan Stevenson (1991) kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok: a. Kolom analitik: garis tengah-dalam 2-6 mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.
b. Kolom preparatif: umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang 25-100 cm. 2.7.2.5 Detektor Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh (Putra, 2007). Detektor yang merupakan tulang punggung kromatografi cair kecepatan tinggi modern (KCKT) ialah detektor UV 254 nm (Edward dan Stevenson, 1991). 2.8 Elusi Gradien dan Isokratik Menurut Putra (2007), elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu: 1. Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap. 2. Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu. Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama suatu analisis kromatografi berlangsung. Pengaruh yang menguntungkan dari elusi gradien adalah memperpendek waktu analisis senyawa-senyawa yang secara kuat ditahan di dalam kolom (Putra, 2007).
2.9 Fase Gerak Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut (Rohman, 2007). Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak. Menurut Putra (2007), fase gerak harus: 1) Murni; tidak ada pencemar/kontaminan 2) Tidak bereaksi dengan pengemas 3) Sesuai dengan detektor 4) Melarutkan cuplikan 5) Mempunyai viskositas rendah 6) Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan 7) Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas Umumnya, pelarut-pelarut dibuang setelah digunakan karena prosedur pemurnian kembali membosankan dan mahal. Dari semua persyaratan di atas, 4 persyaratan pertama adalah yang paling penting (Putra, 2007).
Gelembung udara yang ada harus dihilangkan dari pelarut dengan cara degassing, karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan (Putra, 2007).