ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA DART AYAM ASAL PETERNAKAN DI JAWA TIMUR NANA SURYANA Balai Penelitian Veteriner, JL.R.E.Martadinata. No.30. PO Box 151, Bogor 16114 RINGKASAN Pada awal bulan September 2003 dilaporkan wabah penyakit avian influenza atau flu burung di Indonesia, menimbulkan kematian yang sangat tinggi pada unggas terutama ayam petelur di Pulau Jawa, Sumatera dan Bali. Dari Jawa Timur (Kabupaten Blitar) telah dilakukan pengambilan sampel dari 2 peternakan ayarn petelur umur 11-53 minggu. Hasil isolasi virus dari Jawa Timur dengan menggunakan telur ayam tertunas SPF ternyata 5 isolat positif rapid test dari 7 isolat yang dikoleksi. Kemudian dilakukan identifikasi subtipe isolate virus Al dengan uji HI (Haemoaglutinasi Inhibisi) menggunakan serum-serum positif Al referens yaitu antisera At rnulai Subtipe H I hingga H 15 yang berasal dari Weybride, Inggris. Dari hasil uji HI tersebut dapat disimpulkan bahwa isolat yang berasal dari kabupaten Blitar tersebut merupakan isolat virus At subtipe 1-15N 1. Kata kunci : Isolasi, identifikasi, avian influenza, referens, subtipe H5NI PENDAHtJLUAN Penyakit Avian Influenza (AI) disebut juga penyakit Flu burung adalah penyakit Influenza pada unggas disebabkan oleh virus influenza tipe A yang termasuk dalam famili Orthomyxoviridae, virus ini berukuran 80-120 nm (Easterday dkk.., 1991) Ciri utama Virus Al yaitu memiliki antigen haemaglutinasi ( H ) dan antigen neurominidase ( N ) yang terdapat pada glikoprotein permukaan virus. Pada influenza tipe A terdapat 15 subtipe H ( HI-HI5 ) dan 9 subtipe N (N I -N9 ) yang selanjutnya dapat dibagi kedalam berbagai kombinasi subtipe ( Murphy dan Webster, 1996 ). Semua wabah penyakit AI yang sangat pathogen dan menular disebabkan oleh subtype H5 dan H7 (Swayne dan Suarez, 2000 ). Semua unggas peka terhadap virus Influenza, baik unggas yang dipelihara misalnya ayam, kalkun, burung puyuh, itik, angsa, bebek, maupun unggas yang liar seperti burung kakaktua. Penyakit At dapat ditularkan melalui kontak langsung dengan sumber penularan, yakni sekresi hidung, mata dan feses dari unggas terinfeksi yang masuk melalui mulut, mata dan hidung. Feses yang terkontaminasi virus Al dapat tahan sampai waktu yang sangat lama terutama dalam keadaan sejuk dan lembab (Cidrap, 2004). Penyakit influenza pada unggas bersifat sangat akut dengan gejala klinis. Berupa Kebiru - biruan pada jengger dan pial, leleran hidung dan hipersalivasi, perdarahan subkutan pada kaki dan paha, perdarahan yang menyebar pada lapisan kulit tubuh bagian tengah dada hingga bagian abdomen, diare dan kematian terjadi secara mendadak, angka morbiditas dan mortalitas infeksi mecapai 100 (Damayanti, dkk., 2004). Wabah penyakit At biasanya ditanggulangi dengan berbagai cara antara lain ; dengan diagnosis dan identifikasi yang cepat dan akurat, pemusnahan ayam - ayam yang terinfeksi, isolasi daerah tercemar, mengadakan vaksinasi dan penerapan biosekuritas yang ketat (Swayne dan Suarez, 2000). Setiap negara biasanya mempunyai kebijakan sendiri yang disesuaikan dengan kondisi setempat. Di Indonesia Influenza pada unggas mulai terditeksi pada tahun 1983 yaitu pada ternak itik (Ronoharjo, 1983). Sejak Agustus 2003 hingga sekarang penyakit influenza unggas mewabah pada peternakan unggas dibeberapa daerah di pulau Jawa - Bali, Sumatra dan Kalimantan dengan kematian yang sangat tinggi. Penyebab penyakit influenza unggas tersebut telah berhasil diisolasi dan dikarakterisasi secara lengkap oleh Balai Penelitian Veteriner yaitu berupa virus influenza tipe A dengan subtipe H5NI (Wijono dkk., 2004 ; Damayanti, dkk., 2004 ; Dharma Yanti, dkk., 2004). Diagnosis penyakit selain berdasarkan gejala - gejala klinis perlu didukung dengan pemeriksaan laboratorium yang berupa isolasi dan identifikasi virus. Pada makalah ini dikemukakan teknik isolasi virus At melalui telur ayam berembrio dan kemudian di identifikasi dengan teknik HI test menggunakan serum - serum At referen, pada sample - sample ayam yang berasal dari peternakan di Jawa Tirnur. 186
BAHAN DAN CARA Pengambilan sampel Sampel diambil dari peternakan ayam petelur, umur 11-53 minggu di Kabupaten Blitar (Jawa Timur), yang terserang wabah penyakit AI. Sample organ yang diambil antara lain ; otak, trachea, proventrikulus, usus, caecal tonsil, ginjal, dan paru-paru juga sample dari swab trakhea., organ-organ yang berasal dari ayam diambil secara aseptik kemudian disimpan dalam tabung yang telah berisi medium transport yang mengandung antibiotik 1000 IU (international unit) sesuai dengan metode Pearson dan Senne. (1986) dan OlE (2000) dengan beberapa modifikasi. Sampel selama diperjalanan disimpan didalam es box (termos es ) yang berisi batu es sehingga selalu dalam kondisi dingin. Pada saat sampai di laboratorium semua sampel organ di simpan pada - 20 C. Pembuatan inokulum Usapan mulut (Cotton Swab) yang disimpan didalam ampul-ampul yang berisi tansport media diputar atau disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm selama 30 menit. Supernatannya diambil dan digunakan sebagai inokulum untuk diinokulasikan pada telur ayam betunas umur 1 1 hari.. Untuk semua organ antara lain yaitu Otak, Trachea, Limpa, Proventrikulus, Ginjal, Limpa, Usus, Caecal Tonsil yang disimpan didalam transport media secara terpisah digerus hingga halus dengan menggunakan mortal dan paste kemudian ditambahkan PBS yang mengandung antibiotik ( Penstrep 1000 IU) dijadikan larutan 10%, larutan tadi disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm selama 30 menit dalam suhu 4 C. Supernatan diambil dan dipakai sebagai inokulum yang siap untuk ditumbuhkan kedalam telur ayam bertunas umur 1 1 hari. Isolasi virus pada telur ayam tertunas Untuk isolasi menggunakan telur SPF (Spesifik Pathogen Free) yang diperoleh dari PT Vaksindo Satwa Nusantara. Setiap sampel memerlukan sedikitnya 3 butir telur ayam berembrio. Cara Inokulasi ke telur ayam bertunas untuk isolasi pada bagian Allantoic Cavity (AC) adalah sebagai berikut sediakan telur ayam bertunas umur I I hari. Telur-telur tersebut diperiksa (diteropong) embrionya dengan lampu candling dan diberi tanda tempat penyuntikan. Tempat penyuntikan dipilih sejauh mungkin dari embrio dan pembuluh darah. Daerah disekitar tempat penyuntikan didesinfeksi dengan alkohol 70% dan atau dengan larutan yodium 10%.Tempat penyuntikan pada rongga udara dilubangi dengan jarum penusuk. Inokulum disuntikan sebanyak 0,2 ml per telur melalui lubang yang telah dibuat kedalam kantong alantoik (Allantoic Cavity). Setiap inokulum disuntikan kedalam 3 butir telur ayam bertunas. Lubang tempat penyuntikan ditutup dengan lilin atau malam (wax) atau parafin. Telur-telur kemudian disimpan dalam inkubator bersuhu 37 C, diamati selama 4 hari. Setiap hari telur post-inokulasi diteropong (candling) Telur - telur yang mati setelah diinokulasi dibuka kemudian cairan alantoiknya diambil untuk diuji dengan Uji HA Telur-telur yang tidak mati selama 4 hari dari inokulasi, dibunuh dengan cara memasukan pada suhu 4 C selama semalam. Kemudian dibuka dan cairan alantoiknya diambil dan ditampung kedalam botol/tabung yang seteril secara aseptis untuk diuji Rapid dengan menggunakan set butir darah merah (BDM) ayam 10%. Bila dalam uji rapid test diamati adanya penggumpalan butir darah merah (BDM), maka hal itu merupakan petunjuk bahwa dalam telur tersebut terjadi pertumbuhan virus. Ini berarti virus yang mempunyai daya hemaglutinasi dapat diisolasi. Selanjutnya terhadap isolat ini dilakukan identifikasi. Isolat-isolat virus berupa cairan alantois yang telah diperoleh selanjutnya dilakukan uji HA Haemoaglutinasi ) untuk mengetahui titer virusnya. Kemudian diidentifikasi dengan uji HI (Haemoaglutinasi Inhibisi ) menggunakan serum positif At Referen yaitu antisera At mulai HI hingga H5 yang berasal dari (Weybride, Inggris). Identifikasi subtipe isolat Virus All dengan uji HI menggunakan antisera AI referen Hasil dari isolasi melalui penyuntikan telur ayam tertunas yaitu cairan alantois yang hasil uji rapidnya positif kemudian dilakukan identifikasi dengan uji HI menggunakan beberapa antisera standar, yakni antisera HINI, H2N3, H4N6, H5NI, H6N8, H7, H8N4, H9N2, H1ON9, HI1N6, H12N5 dan H15N6. 187
Prosiding Temu Teknis Nasional 'fenaga Fungsional Pertanian 2005 Prosedur Uji HI Uji hemaglutinasi inhibisi (HI) menggunakan cara standar menurut Alexander (1988) dan OIE (2000). Semua serum standar mulai H1-E115 dilakukan pengenceran dengan posfat buffer saline (PBS) melalui pengenceran seri kelipatan 2 didalam platmikrotiter dasar V (Runcing), sehingga diperoleh 2 kali lipat, 4 kali lipat, 8 kali lipat dan seterusnya sampai 12 kali pengenceran. Setiap enceran volumenya sebanyak 0,025 ml. Setelah itu cairan alantois dari isolat virus yang sudah dititrasi kemudian diencerkan sehingga tnengandung 4 HAU/0,025 ml ditambahkan pada setiap enceran serum dan digoyang dengan alat penggoyang elektri (Mikro Sakher elektrik) selama 30-60 detik. Lalu dibiarkan selama 15-30 etik. Kedalam setiap enceran kemudian ditambahkan 0,025 ml suspensi butir-butir darah merah ayam yang berkonsentrasi 1%. Kemudian mikroplat digoyang dengan alat penggoyang elektrik selama 30-60 detik, setelah itu mikroplate dibiarkan se lam 30-45 menit untuk kemudian dibaca hasilnya. Titer HI didefinisikan sebagai : Hasil pengenceran serum tertinggi yang masih memperlihatkan kegiatan hemaglutinasi inhibisi secara sempurna. Titer HI tersebut diekspresikan dalam bilangan log 2. Hasil pengujian dapat dibaca pada saat kontrol suspensi butir-butir darah merah (BDM) sudah mengendap berupa satu titik didasar lubang plat Isolasi Virus HASIL DAN PEMBAHASAN Dari sample organ dan swab yang diambil pada dua peternakan di kabupaten Blitar kemudian diisolasi pada telur ayam tertunas, terlihat kematian telur terjadi pada saat 18-24 jam setelah penyuntikan, sedangkan pada telur kontrol tidak mengalami kematian. Telur-telur yang mati terinfeksi virus dipanen kemudian dibuka dan diambil cairan alantoisnya/alantois cavity (AC) secara aseptis, setelah dilakukan Uji rapid dan HA dari semua sampel/inokulum, maka 5 (lima) isolat yang cairan alantoisnya dapat mengaglutinasi BDM 10 % pada Rapid test, yaitu cairan alantois yang berasal dari Otak grup A, Swab grup A, Proventrikulus grup A, Otak grup B dan Swab grup B. Hasil Uji HA dari ke 5 (lima) isolat diketahui titernya berkisar antara 2 5 hingga 2'. Dalam pengujian HI terhadap ND dengan menggunakan serum standar yang telah diketahui titernya sebesar 2 7 ternyata satu isolat yang berasal dari otak grup B menunjukan adanya virus ND, sedangkan 4 isolat lainnya yaitu : Otak grup A, Swab grup A, Proventrikulus grup A, dan Swab grup B bukan menunjukan virus ND. Hasil uji Rapid, uji HA dan HI dengan serum standar ND dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. 1-lasil isolasi virus pada telur SPF umur 11 hari setelah 40 jam Sampel Jumlah Inokulasi Pada telor SPF (butir) Hasil Rapid Test Hasil HA HI ND* Pooled otak dari grup A 3 + + + 2' Swab dari grup A 3 + + + 2 6 Pooled proventrikulus dari grup A 3 + + + 2 6 Pooled otak dari grup B 3 + + + 2 5 24 Swab dari grup B 3 + + + 2 5 Pooled otak dari grup C 3 Folikel bulu dari grup C 2 Keterangan : - : tidak terjadi aglutinsi ; + : terjadi aglutinasi ; * : Semua isolate virus diadu dengan serum standar NDdengan titer sebesar 2' yang diperoleh dari ANQAP (Australian National Assurance Program) Subtipe Virus Al Hasil Pengujian subtipe terhadap virus Al dengan menggunakan anti serum referens HI hingga H15 menunjukkan bahwa isolat Proventrikulus grup A mempunyai titer yang sangat tinggi terhadap antisera H5NI, yakni 2 11 walaupun juga menunjukan titer rendah dengan antiserum HINI ( 22 ) dan antiserum H 15N6 ( 2 ; ) sehingga disimpulkan bahwa isolat yang diuji merupakan isolat virus Al dengan subtipe H5N 1. Flasil tersebut dapat dilihat pada Tabel 2 1 8 8
Tabel 2. Pengujian HI isolate Proventrikulus A dengan antiserum referens Antiserum yang digunakan Hasil uji HI isolasi proventrikulus A Nama asal isolate Asal Subtipe \(log 2) A/DK/Alberta/35/76 VLA HINI 2 A/Duck/Genn/1215/73 VLA H2N2 Negatif A/DK/Czech/56 VLA H4N6 Negatif A/Chicken/Scotland/59 VLA H5N I II A/Ostrich/R.S.A/946/98 VLA H6N8 Negatif AV 1369/95/Pakistan CR2 VLA H7 Negatif A/Turk/Ont/61 18/68 VLA H8N4 Negatif A/Tky/ W 1 S/ 1 /66 VLA H9N2 Negatif A/S/Africa/E9.Goose/238/98 VLA HI0N9 Negatif A/Duck/Eng/56/AIS - H11N6 Negatif A/DK/Alberta/60/76 VLA H 12N5 Negatif A/Sherwater/WA/2576/79 VLA H 15N6 Negatif KESIMPULAN DAN SARAN Berdasarkan hasil isolasi dengan menggunakan telur ayam SPF tertunas umur 1lhari,yang kemudian dilakukan uji rapid, uji HA dan uji HI dengan antisera referens Al dengan subtipe HI hingga H15 maka dapat diisolasi sebanyak 4 (empat) isolat virus Al subtipe H5N I yang berasal dari daerah Jawa Timur ( Kabupaten Blitar ). Untuk menentukan patogenitas dan karakterisasi masih diperlukan uji lainya seperti salah satunya yaitu uji RT-PCR. Cara pengambilan dan penanganan sampel secara steril, baik dan benar serta pengiriman yang cepat dan sesuai prosedur ke laboratorium adalah salah satu faktor utama untuk memperoleh hasil peneguhan diagnosis laboratorium secara baik dan tepat. Ketersediaan bahan dan sarana yang memadai pada laboratorium merupakan hal yang mutlak untuk menunjang keberhasilan pada laboratorium diagnostik. UCAPAN TERIMA KASIH. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Drh.NLP. Indi Dharmayanti, MS dan Dr. Agus Wiyono yang telah banyak membantu dalam menyelesaikan penulisan karya tulis ini DAFTAR BACAAN Alexander D.J. 1988. Criteria for the definition of pathogenicity of avian influenza viruses. Proc. Of the Second International Symposium on Avian Influenza. Goergia, USA, September 3-5, 1986, pp. 228-245 Damayanti, R, NLP. I. Dharma Yanti, R, Indriani, T. Syafirati, L. Parede, A. Wiyono dan Darminto. 2004a. Gambaran klinis dan patologis ayam yang terserang flu burung sangat patogenik (HPAI) di beberapa peternakan di Jawa Timur dan Jawa Barat. JITV (In Press) Damayanti, R, NLP. 1. Dharma Yanti, R, Indriani, T. Syafirati, L. Parede, A. Wiyono dan Darminto 2004. Idenfikasi virus avian influenza isolate local Indonesia dengan Reverse Transcriptase-Polymerase Chain reaction (RT-PCR). JITV (In Press). Easterday, B.C. anf V.S. Hinshaw. 1991. Avian influenza. In : Disease of Poultry 9` h ed. B.W. Calnex, H.J. Barnes, C.W. Beard, W.M. Reid and h.w. yoder (Jr) (Eds). Iowa State University Press, Ames. Pp. 532-551. Murphy, B.R. and R.G. Wedster. 1996. Orthomyxoviruses. In : Fields Virology, B.N. FIELDS, D.M. KNIFE and P.M. HOWLEY (eds). 3` d wd. Lippincortt-Raven, Philadelphia Pa. pp. 1397-1445. Ronohardjo, P. 1983. Penyakit Cengesan atau Selesma pada Itik Tegal, Bali dan Alabio. Penyakit Hewan XV (25), Semester l : 61-71. 1 8 9
Swayne, D.E. and Suaarez D.L. 2000. Highly pathogenic avian influenza. In : Deseases of Poultry : world trade and public health implications. BEARD CW and McNULTY MS (Eds). Rev. Sci. Tech. Int. Epiz. 19(2) : 463-482. Wiyono, A., R. Indriani, NLP. I., Dharma yanti, R. Damayanti dan Darminto. 2004. lsolasi dan karakterisasi virus highly pathogenic avian influenza subtipe H5 dari ayam asal wabah di Indonesia. JITV 9 : 61-71. 1 90