40 BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan menggunakan rancangan pretest - posttest control group design (Campbell & Stanly, 1996). Skema rancangan penelitian adalah sebagai berikut : O1 P0 O2 P S R O3 P1 O4 Bagan 4.1 Rancangan Penelitian Keterangan : P = Populasi tikus betina obes (galur wistar) obesitas umur 90 hari. S = Sampel tikus betina obes (galur wistar) obesitas umur 90 hari dengan berat badan 300 g. R = Random O1, O3= Pengukuran berat badan tikus betina obes (galur wistar) sebelum perlakuan P0 = Perlakuan dengan injeksi NaCl 0,9% pada subkutan disertai diet tinggi kalori & lemak. P1 = Perlakuan dengan injeksi phosphatydilcoline 5% pada subkutan disertai diet tinggi kalori & lemak. O2 = Kondisi setelah pemberian injeksi dengan NaCl pada subkutan disertai diet tinggi kalori dan lemak setiap minggu selama 4 minggu O4 = Kondisi setelah pemberian injeksi phosphatydilcoline 5% pada subkutan setiap minggu selama 4 minggu.
41 4.2 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratory Animal Unit. Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana. Waktu penelitian dimulai bulan Oktober 2010. 4.3 Populasi dan Sampel 4.3.1 Populasi Subyek penelitian adalah tikus betina obes (galur wistar) (Rat strain wistar) berusia 90 hari dengan berat badan 300 gr yang diperoleh dari Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana. 4.3.2 Kriteria Sampel 4.3.2.1 Sampel Inklusi Kriteria inklusi yang ditetapkan sebagai sampel adalah sebagai berikut: a. Tikus betina obes (galur wistar) obesitas b. Umur 90 hari c. Berat badan antara 290 300 gram. 4.3.2.2 Sampel Gugur a. Tikus sakit b. Umur tikus betina obes (galur wistar) kurang dari 65 hari atau lebih dari 110 hari 4.3.3 Besar Sampel Besarnya sampel ditentukan berdasarkan rumus Pocock (1984): p1 x (100-p1) + p2 x (100-p2) n = x f (α, β) (p1 p2) 2 p1 = persentase berat badan tikus betina obes (galur wistar) setelah injeksi Phosphatydilcholine. p2 = persentase berat badan tikus betina obes (galur wistar) setelah injeksi dengan placebo NaCl
42 f (α, β) = fungsi α dan β sesuai dengan tabel. Pada penelitian ini, p1 = 85% (penurunan BB tikus betina obes (galur wistar) yang diharapkan dari Injeksi Phospha-tydilcholine) p2 = 20% (penurunan BB tikus betina obes (galur wistar) yang dharapkan dari injeksi placebo) α = 0,05 β = 0,1 85 x (100-85) + 20 x (100-20) n = x 10,5 (85 20) 2 (85x15) + (20x80) n = x 10,5 4225 1275 + 1600 n = x 10,5 4225 = 0,680 x 10,5 = 7,144 = 8 ekor Berdasarkan hasil tersebut, jumlah subyek dalam penelitian ini menjadi 2 x 8 = 16 ekor, dalam penelitian jumlah tikus betina obes (galur wistar) ditambah 15 % sehingga menjadi 20 ekor. 4.3.4 Teknik Penentuan Sampel Teknik penentuan sampel dilakukan dengan cara sebagai berikut: a. Dari populasi tikus betina obes (galur wistar) (Rat galur wistar) diadakan pemilihan sampel berdasarkan kriteria inklusi: obesitas, umur 90 hari dan berat minimal 300 gram. b. Dari jumlah sampel yang telah memenuhi syarat diambil secara random untuk mendapatkan jumlah sampel.
43 c. Dari sampel yang telah dipilih kemudian dibagi 2 kelompok secara random yaitu kelompok kontrol (PO) dan kelompok I (P1). Masing-masing kelompok dengan jumlah sampel yaitu 10 ekor tikus betina obes (galur wistar). Dan masing-masing diberi diet tinggi kalori dan lemak. 4.4 Variabel Penelitian 4.4.1 Klasifikasi Variabel Penelitian Variabel penelitian dibedakan menjadi: 1. Variabel Bebas : yaitu pemberian suntikan phosphatydilcholine. 2. Variabel Tergantung: penurunan berat badan tikus betina obes (galur wistar) 3. Variabel Terkendali: - Varian tikus betina obes (galur wistar) - Jenis kelamin, umur dan berat badan tikus betina obes (galur wistar) - Pencahayaan, suhu, kelembaban, nutrisi, kandang. VARIABEL BEBAS Phosphatydilcholine VARIABEL TERGANTUNG Penurunan Berat Badan VARIABEL TERKENDALI Varian tikus betina obes (galur wistar) Jenis kelamin, umur, berat badan tikus betina obes (galur wistar) Pencahayaan, suhu, kelembaban, nutrisi, kandang Gambar 4.2. Skema Hubungan antara Variabel Penelitian
44 4.4.2 Definisi Operasional Variabel Untuk keseragaman pengertian maka variabel-variabel tersebut didefinisikan sebagai berikut : 1. Phosphatydilcholine adalah suatu fosfolipid yang dapat mengemulsi lemak. Senyawa yang digunakan dalam penelitiannya ini berasal dari ekstrak kacang kedelai yang diformulasikan dalam bentuk sediaan ampul dengan volume 5 ml. Phosphatydilcholine yang dipakai saat ini adalah dengan nama dagang Lipostabil (Aventis Pharma, Grup Sanofi-Aventis, Paris, Perancis) 2. Berat badan adalah berat tikus betina yang diukur dengan timbangan analitik. Berat diukur dalam satuan gram. Tikus betina (galur wistar) yang dipilih dalam penelitian ini, memiliki berat badan antara 290-300 gram. 3. Usia tikus adalah 90 hari dihitung dari saat kelahirannya. 4. Injeksi subkutan adalah injeksi pada lapisan subkutan yang mengandung banyak jaringan lemak, biasa terletak diantara kulit dan otot. 5. Teknik penyuntikan yaitu ketrampilan penyuntikan pada subjek penelitian. Dalam hal ini lokasi penyuntikan adalah pada daerah perut tikus betina obes (galur wistar) yang banyak mengandung lemak. Titik penyuntikan dibagi menjadi 5 titik, dimana titik-titik ini tersebar pada perut tikus betina obes (galur wistar). 6. Ketrampilan teknis adalah kemampuan teknis peneliti untuk melakukan penyuntikan pada tikus betina obes (galur wistar). Ketrampilan ini penting karena lokasi penyuntikan pada daerah yang banyak mengandung lemak yang berada pada lapisan subkutan tikus. Sehingga perlu dikerjakan oleh peneliti yang terampil dan terlatih. 7. Temperatur ruangan adalah suhu tempat kerja peneliti, penelitian dilaksanakan pada keadaan suhu relatif stabil yaitu pada suu 23 C, sehingga pengaruhnya terhadap hasil penelitian dapat diabaikan. 8. Kondisi peneliti yang meliputi kesehatan fisik maupun psikis peneliti. Penelitian dilaksanakan saat kondisi peneliti dalam keadaan baik sehingga pengaruhnya terhadap hasil penelitian dapat diabaikan.
45 4.5 Bahan dan Alat Penelitian 4.5.1 Bahan Penelitian 1. Tikus betina obes (galur wistar) obesitas umur 90 hari dengan berat badan antara 290-300 g. 2. Phosphatydilcholine yang digunakan dalam penelitian ini adalah Lipostabil produksi Aventis dengan volume 5 ml. Gambar 4.3. Preparat Phosphatidylcholine dengan merek dagang Lipostabil 3. Larutan NaCl 0,9% yang digunakan dalam penelitian ini adalah produksi Otsuka sediaan 25 ml 4.5.2 Alat Penelitian 1. Kandang tikus betina dengan kelengkapan tempat makanan dan minuman 2. Timbangan analitik 3. Spuit tuberculin 1 cc, spuit 5 cc 4. Jarum 32G 0,26 x 4 mm 5. Sarung tangan
46 4.6 Prosedur Penelitian Penelitian dilakukan sebagai berikut: 4.6.1 Pengambilan subyek dan jumlah subyek penelitian Kecenderungan terjadinya peningkatan berat badan, banyak dialami oleh orang dewasa usia 25 45 tahun. Berdasarkan hal tersebut: 1. Sampel tikus betina obes (galur wistar) varian Rattus Norvegicus galur wistar 2. Umur 90 hari karena umur tikus betina obes (galur wistar) dewasa berkisar 65-110 hari. 3. Berat badan tikus betina obes (galur wistar) yang dipilih minimal memiliki berat badan 300 gram. 4. Tikus betina obes (galur wistar) yang digunakan pada penelitian ini sebanyak 20 ekor. 5. Tikus betina obes (galur wistar) dibagi menjadi 2 kelompok masing-masing berjumlah 10 ekor. 6. Tikus betina obes (galur wistar) diadaptasi selama 3 hari, masing-masing tikus betina obes (galur wistar) dari setiap kelompok ditimbang terlebih dahulu berat badannya. 7. Kelompok kontrol terdiri dari 10 ekor yang diberi suntikan subkutan placebo berupa NaCl 0,9% sebanyak 0,02 ml/minggu, yang disuntikkan pada 5 titik suntikan pada perut tikus betina obes (galur wistar) selama 4 minggu. 8. Kelompok P1 (Perlakuan 1) terdiri dari 10 ekor tikus betina obes (galur wistar) yang diberi perlakuan suntikan subkutan Phosphatydilcholine 5% 0,045 mg/minggu (0,02 ml) yang disuntikkan pada 5 titik suntikan pada perut tikus betina obes (galur wistar) selama 4 minggu. 9. Setiap 7 hari perlakuan, tikus betina obes (galur wistar) post test dari masing-masing kelompok ditimbang berat badannya.
47 4.6.2 Perhitungan dosis Phosphatydilcholine untuk subyek penelitian Perhitungan dosis digunakan konversi dari manusia (berat badan 60-70 kg) ke tikus betina obes (galur wistar) (300 g) adalah 0,018. Dosis manusia 5 cc (250 mg Phosphatydilcholine) setelah dikonversi pada tikus betina obes (galur wistar) menjadi 0,018 x 250 mg = 0,045 mg (tabel Kusumawati, 2004). Untuk dosis 250 mg injeksi Phosphatydilcholine menjadi 0,18 mg. Sediaan yang dipakai dalam penelitian ini adalah 1 ampul Phosphatydilcholine mengandung 250 mg/5 ml (50mg/ml). volume yang diambil adalah 0,1 ml untuk dosis 250 mg Phosphatydilcholine, karena volume maksimal untuk injeksi intramuscular pada tikus betina obes (galur wistar) adalah 0,1 ml. Bila volume injeksi melebihi dari volume maksimal maka akan terjadi perenggangan jaringan pada tempat injeksi yang akan mengakibatkan kerusakan jaringan atau tidak teraturnya absorpsi bahan uji tersebut (Ngatidjan, 2006). Jadi pengenceran yang dilakukan sebagai berikut: Volume yang diambil 0,1 ml = 0,18 mg = 100 mg = 0,1 ml Pengenceran (ml) = 100 x 0,1 0,18 = 55,55 ml aquabides Setelah 1 minggu kesepuluh ekor tikus betina obes (galur wistar) diukur berat badannya. Pengukuran dilakukan setiap minggu selama 4 minggu. Penelitian mengambil tikus betina obes (galur wistar) umur 90 hari disesuaikan dengan kecenderungan peningkatan berat badan di usia 25 45 tahun. Umur 90 hari pada tikus betina obes (galur wistar) karena umur tikus betina obes (galur wistar) dewasa (saat dikawinkan) berkisar antara 65-110 hari. 4.6.3 Pemantauan Keselamatan Tikus di Laboratorium Pemantauan keselamatan tikus betina obes (galur wistar) di laboratorium (Smith et al, 1988; Ngatidjan, 2006) antara lain : a. Kandang tikus betina obes (galur wistar) harus cukup kuat tidak mudah rusak, mudah dibersihkan (satu kali seminggu), mudah dipasang lagi, hewan tidak mudah lepas, harus tahan gigitan dan hewan tampak jelas
48 dari luar. Alas tempat tidur harus mudah menyerap air pada umumnya dipakai serbuk gergaji atau sekam padi. b. Menciptakan suasana lingkungan yang stabil dan sesuai dengan keperluan fisiologi tikus betina obes (galur wistar) (suhu, kelembaban dan kecepatan pertukaran udara yang ekstrim harus dihindari). c. Untuk tikus betina obes (galur wistar) dengan berat badan 200-300 gram luas lantai tiap ekor tikus betina obes (galur wistar) adalah 600 cm2, tinggi 20,0 cm. d. Tikus betina obes (galur wistar) harus diperlakukan dengan kasih sayang. 4.7 Pengolahan dan Analisis Data Analisis data yang digunakan adalah: 1. Analisis deskriptif 2. Analisis normalitas dengan Uji Shapiro-Wilk dan Uji kehomogenan variansi dengan Uji Levene s Test. 3. Analisis komparasi. Jika data menyebar normal dan homogen maka digunakan uji T-independent. (Gomez and Gomez, 1995, Steel and Torrie, 1980). Data diolah dengan program SPSS Version 17.0 for windows. 4. Untuk mengetahui penurunan berat badan, pada masing-masing kelompok diuji dengan uji T-paired bila data berdistribusi normal.