11 HASIL DAN PEMBAHASAN Berdasarkan isolasi dan identifikasi bakteri pada saluran reproduksi A. atlas didapatkan hasil seperti tersaji pada Tabel 2 sampai Tabel 7 berikut ini. Tabel 2 Hasil isolasi bakteri saluran reproduksi imago betina A. atlas dengan media agar darah Agar Darah 1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B Ukuran Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Sedang Bentuk Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Bulat Permukaan Halus Halus Halus Halus Halus Halus Halus Halus Aspek Tepi Rata rata Rata rata Rata rata Rata rata Elevasi Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Cembung Sifat - - - - - - - - tembus Warna Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Krem Hemolisis - β - β - β - β Dari sampel yang diisolasi pada agar darah (Tabel 2) didapatkan dua jenis koloni bakteri berbeda. Koloni A yang berukuran sedang, berbentuk bulat, permukaan halus, aspek tidak, tepi rata, elevasi cembung, berwarna krem, dan tanpa adanya hemolisis pada agar darah. Koloni B yang berukuran sedang, berbentuk bulat, permukaan halus, aspek tidak, tepi tidak rata, elevasi cembung, berwarna krem, dan menghasilkan beta-hemolisis. Hal ini menunjukkan bahwa koloni B mampu melisiskan butir darah merah yang terlihat sebagai wilayah jernih di sekitar koloni. Bila proses lisis sempurna akan terlihat wilayah yang benar-benar jernih dan jenis hemolisisnya disebut beta-hemolisis (Lay 1994). Tabel 3 Hasil isolasi bakteri saluran reproduksi imago betina A. atlas dengan media Mac Conkey Agar Mac Conkey Agar 1 2 3 4 Ukuran Kecil Kecil Kecil Kecil Bentuk Bulat Bulat Bulat Bulat Permukaan Halus Halus Halus Halus Aspek Mengkilat Mengkilat Mengkilat Mengkilat Tepi Rata Rata Rata Rata Elevasi Cembung Cembung Cembung Cembung Sifat tembus - - - - Warna Krem Krem Krem Krem Dari media MCA (Tabel 3) didapatkan satu jenis koloni yang berukuran kecil, berbentuk bulat, permukaan halus, aspek, tepi rata, elevasi cembung, berwarna krem. Warna koloni yang sama dengan warna media atau tidak memperlihatkan perubahan pada media menunjukkan bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa. Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa biasanya bersifat patogen (Lay 1994).
12 A B C Gambar 4 Koloni bakteri yang tumbuh pada media agar darah dan MCA. (A) koloni bakteri pada agar darah non-hemolitik, (B) koloni bakteri pada agar darah β- hemolitik, (C) koloni bakteri pada MCA. Tabel 4 Hasil pewarnaan Gram bakteri pada saluran reproduksi imago betina A. atlas dari media agar darah Pewarnaan Gram 1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B Morfologi Batang halus Batang Batang halus Batang Batang halus Batang Batang halus Batang Susunan Tunggal Berantai Tunggal Berantai Tunggal Berantai Tunggal Berantai Warna Merah Ungu Merah Ungu Merah Ungu Merah Ungu Spora - Ada - Ada - Ada - Ada Gram Negatif Positif Negatif Positif Negatif Positif Negatif Positif Tabel 5 Hasil pewarnaan Gram bakteri pada saluran reproduksi imago betina A. atlas dari media Mac Conkey Agar Pewarnaan Gram 1 2 3 4 Morfologi Batang Batang Batang Batang Susunan Tunggal Tunggal Tunggal Tunggal Warna Merah Merah Merah Merah Gram Negatif Negatif Negatif Negatif Koloni bakteri terpisah yang didapatkan selanjutnya dibiakkan ke dalam media agar miring trypticase soy agar (TSA) yang merupakan media agar yang digunakan untuk kegiatan pengisolasian berbagai macam mikroorganisme yang bersifat aerobik. Biakan murni yang tumbuh pada media agar darah (Tabel 4) dan MacConkey Agar (Tabel 5) diuji dengan pewarnaan Gram untuk melihat bakteri tersebut merupakan bakteri Gram positif atau negatif. Biakan murni adalah biakan yang hanya berisi satu jenis bakteri (Pelczar dan Chan 1988). Koloni A yang berasal dari media agar darah berbentuk batang halus, susunan tunggal, dan berwarna merah yang menunjukkan bakteri Gram negatif. Koloni B yang berasal dari media agar darah berbentuk batang, susunan berantai, berwarna ungu dan memiliki spora yang menunjukkan bakteri Gram positif. Koloni yang berasal dari media MCA berbentuk batang, susunan tunggal, berwarna merah yang menunjukkan bakteri Gram negatif.
13 A B C Gambar 5 Hasil pewarnaan Gram bakteri pada media agar darah dan MCA. (A) koloni bakteri pada agar darah non-hemolitik, (B) koloni bakteri pada agar darah β- hemolitik, (C) koloni bakteri pada MCA. A B C Tabel 6 Hasil pengujian biokimia bakteri pada saluran reproduksi reproduksi imago betina A. atlas dari media agar darah Pengujian Biokimia 1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B Oksidase + + + + TSIA Slant Basa Basa Basa Basa Butt Asam Asam Basa Basa Gas + + + + H 2S - - - - Indol + + - - Urea - - + + Sitrat + + + + Voges Proskauer + + - - Glukosa +/Gas (+) +/Gas (+) -/Gas (-) -/Gas (-) Sukrosa +/Gas (+) +/Gas (+) -/Gas (-) -/Gas (-) Laktosa +/Gas (+) +/Gas (+) -/Gas (-) -/Gas (-) Manitol +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) Maltosa +/Gas (+) +/Gas (+) -/Gas (-) -/Gas (-) Hasil identifikasi Aeromonas Bacillus Aeromonas Bacillus Pseudomonas Bacillus Pseudomonas sp Bacillus Tabel 7 Hasil pengujian biokimia bakteri pada saluran reproduksi imago betina A. atlas dari media MacConkey Agar Pengujian Biokimia 1 2 3 4 Oksidase + + + + TSIA Slant Basa Basa Basa Basa Butt Asam Asam Asam Asam Gas + + + + H 2S - - - - Indol + + - - Motilitas - - - - Urea - - - - - Sitrat + + + + Voges Proskauer + + + + Glukosa +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) Sukrosa +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) Laktosa +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) Manitol +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) Maltosa +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) +/Gas (+) Hasil identifikasi Aeromonas Aeromonas Aeromonas schubertii Aeromonas schubertii
14 A B C Gambar 6 Hasil uji oksidase. (A) kontrol negatif oksidase menggunakan Escherichia coli dan Salmonella, (B) hasil positif dari koloni bakteri gram negatif pada agar darah, (C) hasil positif dari koloni bakteri Gram negatif pada MCA. Isolat bakteri yang berasal dari media agar darah (Tabel 6) dan MacConkey Agar (Tabel 7) selanjutnya dilakukan pengujian biokimia dengan menggunakan media Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Indol, Simmon s citrate agar, Voges-Proskauer (VP), urea, dan kaldu gula-gula (glukosa, sukrosa, laktosa, manitol, dan maltosa). Hasil uji menggunakan media TSIA pada bagian slant dan butt bersifat basa-asam (merah-kuning) dengan gas, serta tidak memproduksi H2S mengarah pada genus Morganella, Providencia, Salmonella, Plesiomonas, Hafnia, Serratia, Shigella, Yersinia, Aeromonas, Escherichia dan Enterobacter. Pada bagian slant dan butt bersifat basa-basa (merah) mengarah pada Pseudomonas (Mahon et al. 2007). Hasil positif didapatkan pada uji oksidase terhadap semua isolat bakteri, hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan famili non- Enterobacteriaceae yang terdiri dari genus Campylobacter, Helicobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Vibrio, Neisseria, dan Alcaligenes. (Bergey dan Breed 1994). ditemukannya bakteri famili Enterobacteriaceae disebabkan imago A. atlas yang sebelumnya sudah tidak melakukan aktivitas makan setelah menjadi pupa. Hasil positif pada uji indol mengarah pada Aeromonas, Edwardsiella, Escherichia coli, Flavobacterium, Haemophilus influenza, Klebsiella oxytoca, Proteus, Plesiomonas shigelloides, Pasteurella multocida, Pasteurella pneumotropica dan Vibrio. Hasil negatif mengarah pada Actinobacillus, Aeromonas schubertii, Alcaligenes, Bordetella, Enterobacter, Haemophillus, Klebsiella, Neisseria, Pasteurella haemolytica, Pasteurella ureae, Proteus mirabilis, Proteus penneri, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, dan Yersinia (MacFaddin 1980). Hasil uji indol positif yang didapatkan sesuai pernyataan Abbot et al. (2003) yang menyatakan sembilan spesies anggota Aeromonas (A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida, A. caviae, A. media, A. eucrenophila, A. sobria, A. veronii, dan A. veronii bv. sobria) semuanya memberikan hasil positif untuk uji indol. Hasil negatif hanya ditunjukkan satu spesies yaitu A. schubertii (Awan et al. 2005). Hasil uji urea mendapatkan hasil positif yang menunjukkan bahwa bakteri mampu menghasilkan enzim urease yang mengurai urea menjadi ammonium dan CO2, hidrolisis urea ditunjukkan dengan perubahan warna media dari merahjingga menjadi merah ungu (Lay 1994). Hasil negatif menunjukkan tidak ada perubahan warna pada media. Hasil uji sitrat positif pada semua isolat bakteri hal ini menunjukkan bahwa bakteri dapat menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi (Lay 1994).
Hasil uji Voges-Proskauer positif mengarah pada Enterobacter, Klebsiella, Serratia marcescens, Hafnia alvei, Vibrio damsela, dan Vibrio alginolyticus. Hasil negatif mengarah pada Citrobacter, Shigella, Yersinia, Edwardsiella, Salmonella, Vibrio furnissii, Vibrio fluvialis, Vibrio vulnificus, dan Vibrio parahaemolyticus (Bergey dan Breed 1994). Hasil uji kaldu gula-gula berupa glukosa, sukrosa, laktosa, manitol, dan maltosa menunjukkan hasil positif dan menghasilkan gas mengarah pada genus Aeromonas dan Vibrio (Bergey dan Breed 1994). Hasil negatif pada semua kaldu gula kecuali manitol mengarah pada genus Pseudomonas sp (Bergey dan Breed 1994). Menurut Woo dan Bruno (2011), Aeromonas mampu memfermentasi fruktosa, galaktosa, maltosa, trehalosa, manitol, sukrosa, glukosa, dextrin dan glikogen, memberikan hasil uji positif pada uji indol, memproduksi gas dari glukosa. Dari hasil isolasi dan identifikasi yang telah dilakukan, didapatkan hasil Gram positif, dengan bentuk morfologi batang, diisolasi pada kondisi aerob, dan memiliki spora mengarah pada genus Bacillus (Bergey dan Breed 1994; Lay 1994). Bakteri Gram negatif dengan bentuk morfologi batang dan hasil positif pada uji oksidase mengarah pada Aeromonas, Pseudomonas, dan Vibrio hal ini sesuai dalam Bergey s Manual of Determinative Bacteriology (Bergey dan Breed 1994). Dari hasil pengujian secara biokimia isolat bakteri didapatkan hasil bakteri Gram positif berupa Bacillus, Gram negatif berupa Aeromonas, Aeromonas schubertii, dan Pseudomonas. Hasil penelitian ini sesuai dengan Anand et al. (2010) yang berhasil mengisolasi Bacillus circulans, Aeromonas dan Pseudomonas aeruginosa pada saluran pencernaan B. mori. Ditemukannya bakteri tersebut berguna sebagai pendegradasi polisakarida dalam proses pencernaan B. mori terhadap daun murbei. Bakteri ini diisolasi dari saluran reproduksi imago betina A. atlas diduga berasal dari fase larva sebagai mikroflora normal yang kemudian bertahan sampai fase imago. Hasil ini juga sesuai dengan Sakthivel et al. (2012) yang berhasil mengidentifikasi Pseudomonas fluorescence, Bacillus subtilis dan Bacillus cereus pada larva ulat sutera B. mori yang sakit. Hal ini dikuatkan dengan pernyataan Cappellozza et al. (2011) dan Manimegalai (2009) dalam buku Silk Biomaterials for Tissue Engineering and Regenerative Medicine (Kundu 2014), yang menyatakan bahwa bakteri yang paling umum yang menginfeksi B. mori adalah Streptococcus, Pseudomononas aeruginosa, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus bombyseptiseus, Staphylococcus aureus, Serratia marcescens dan Enterococcus mundtii. Hasil penelitian ini juga sesuai dengan pernyataan Badan Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BKIPM 2011) yang melakukan pemantauan daerah sebar Hama dan Penyakit Ikan Karantina (HPIK) di wilayah Purwakarta yang mengidentifikasi Aeromonas hydrophila, Yersinia enterocolitica, Aeromonas schubertii, Aeromonas media, Citrobacter freundii, Bacillus, dan Aeromonas popoffii. Hal ini membuktikan bahwa bakteri yang berhasil diidentifikasi berasal dari penyebaran Aeromonas Aeromonas schubertii, dan Bacillus pada lingkungan di wilayah Purwakarta. Bacillus secara alami terdapat dimana-mana, dan termasuk spesies yang hidup bebas atau bersifat patogen. Beberapa spesies Bacillus menghasilkan enzim ekstraseluler seperti protease, lipase, amilase, dan selulase yang bisa 15
16 membantu pencernaan dalam tubuh hewan (Wongsa dan Werukhamkul, 2007). Aeromonas hydrophila dan Aeromonas schubertii dapat ditemukan diberbagai lingkungan perairan seperti air tanah, air permukaan, air payau, air laut, dan air limbah (EPA 2006) termasuk di air kolam ikan (Wulandari 2012). Bakteri ini biasanya patogenik pada hewan seperti ikan, reptil, dan jarang pada mamalia (Quinn et al. 2002). Aeromonas merupakan patogen, baik pada manusia maupun hewan (ikan, amfibi, reptil) (EPA 2006). Pseudomonas secara luas dapat ditemukan di alam, contohnya di tanah, air, tanaman, dan hewan. Pseudomonas adalah patogen oportunistik yaitu memanfaatkan kerusakan pada mekanisme pertahanan inang untuk memulai suatu infeksi (Boel 2004). Bakteri ini merupakan salah satu jenis mikroflora normal pada saluran pencernaan dan kulit manusia, namun terkadang bakteri ini juga dapat berubah menjadi patogen oportunistik yang menyebabkan bronkopneumonia kronis pada manusia saat kondisi imun tubuh menurun (Tellez et al. 2010). SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Berdasarkan hasil penelitian telah diidentifikasi tiga genus bakteri, terdiri dari Bacillus, Aeromonas, dan Pseudomonas dengan satu spesies bakteri Gram negatif yakni Aeromonas schubertii dari saluran reproduksi imago betina ulat sutera liar A. atlas yang berasal dari perkebunan teh PTPN VIII Purwakarta, Jawa Barat. Semua bakteri yang berhasil diidentifikasi merupakan bakteri patogen dan patogen oportunistik. Saran Diperlukan studi lanjutan untuk mengidentifikasi bakteri sampai tingkatan spesies dengan memperbanyak jenis uji biokimiawi dan atau menggunakan polymerase chain reaction (PCR). Selain itu perlu penelitian lain untuk mengidentifikasi mikroorganisme selain bakteri yang hidup dalam saluran reproduksi imago betina ulat sutera liar A.atlas atau organ yang lain. DAFTAR PUSTAKA Abbot SL, Sharon W, Cheung KW, Janda JM. 2003. The genus Aeromonas : biochemical characteristics, atypical reaction, and phenotypic identification schemes. J. Clin. Microbiol 41: 2348. Anand AAP, Vennison SJ, Sankar SG, Prabhu DIG, Vasan PT, Raghuraman T, Geoffrey CJ, Vendan SE. 2010. Isolation and characterization of bacteria from the gut of Bombyx mori that degrade cellulose, xylan, pectin, and starch and their impact on digestion. Journal of Insect Science 10: 107.