BAHAN DAN METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2011 hingga bulan Maret 2012 bertempat di Laboratorium Helmintologi Bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan dan Laboratorium Bakteriologi Bagian Mikrobiologi Medis, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel ikan nila hitam, NaCl fisiologis, alkohol bertingkat (70%, 85%, 95%, 100%), alkohol absolut, alkohol 70%, kalium hidroksida 10%, minyak cengkeh, pewarna Semichon s Acetocarmine, entelan, xylol, aquades, agar darah (Blood Agar), agar Mac Conkey Agar (MCA), Nutrient Agar, pewarna Gram, agar miring, glukosa, sukrosa, maltosa, laktosa, manitol, indol, TSIA, sitrat, KOH 10% dan KOH 4%. Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah seperangkat alat bedah, timbangan, cawan petri, pinset, kait, pipet tetes, gunting, botol kaca, spidol, label nama, gelas objek dan kaca penutup, mikroskop cahaya, mikroskop stereo, video mikroskop, bunsen, ose, needle, tabung reaksi dan rak tabung reaksi. Metode Penelitian Teknik Pengambilan Sampel Sampel ikan diambil dari kolam petani ikan nila hitam di daerah Parung Kabupaten Bogor sebanyak 10 ekor dengan berat rata-rata 300 gram. Ikan nila hitam yang masih hidup dimatikan dengan cara menusuk bagian medial kepala tepat di otak. Insang ikan dikeluarkan kemudian diletakkan ke dalam cawan petri yang telah diisi dengan NaCl fisiologis. Rongga perut ikan dibuka kemudian saluran pencernaan (usus dan lambung) dikeluarkan diletakkan ke dalam cawan petri yang telah diisi NaCl fisiologis.
Teknik Parasitologi Insang dan saluran pencernaan yang sudah dipreparir selanjutnya disimpan dalam refrigerator selama 10 jam untuk merelaksaskikan cacing yang ada. Kemudian insang disisir di bawah mikroskop stereo untuk mengoleksi cacing. Saluran pencernaan dibuka lumennya kemudian diamati di bawah mikroskop stereo untuk mengoleksi cacingnya. Cacing yang ditemukan kemudian difiksasi di dalam alkohol 70% sebelum diwarnai. Pewarnaan Cacing Pada penelitian ini digunakan dua jenis teknik pewarnaan, yaitu pewarnaan permanen untuk trematoda dan pewarnaan semi permanen untuk nematoda. Pewarnaan permanen atau dikenal juga dengan pewarnaan Semichon s-acetocarmine biasa digunakan untuk mengindentifikasi cacing pipih (golongan trematoda). Tahap pertama dalam pewarnaan ini adalah dengan merendam spesimen dalam larutan Semichon s-acetocarmine selama 15-20 menit (sampai warna terserap dan spesimen berubah warna menjadi merah cerah). Setelah itu spesimen dibilas dengan menggunakan alkohol 70% kemudian direndam di dalam larutan asam alkohol (99 bagian alkohol 70%, dicampur dengan 1 bagian HCl). Kemudian dilakukan dehidrasi pada spesimen dengan menggunakan alkohol bertingkat (70%, 85%, 95%, 100%) dengan cara merendamnya selama 5 menit pada setiap konsentrasi alkohol. Setelah itu spesimen direndam di dalam xylol sampai spesimen terlihat tembus pandang. Langkah terakhir adalah spesimen di-mounting dengan entelan sebagai media fiksasi (Soulbsy 1982). Teknik pewarnaan semi permanen menggunakan KOH dan minyak cengkeh yang diaplikasikan untuk pewarnaan nematoda. Menurut Khairunnisa (2007) tahapan pewarnaannya ialah penipisan dan penghilangan lapisan kutikula cacing yang dilakukan dengan cara merendam spesimen dalam KOH 10% selama 1-3 menit sampai lapisan kutikula terlihat tembus pandang. Setelah itu spesimen dipindahkan ke dalam minyak cengkeh selama kurang lebih 30 detik sampai 1 menit sampai organ-organ tubuh terlihat jelas. Kemudian cacing didehidrasi dengan dimasukkan ke dalam alkohol bertingkat (70%, 85%, 95%) masing-
masing selama 15 sampai 30 detik. Spesimen yang telah didehidrasi di-mounting dengan entelan sebagai media fiksasi.
Teknik Bakteriologi Ikan Penimbangan Pengambilan sampel (insang & digesta) Penggerusan Pewarnaan Gram Agar Darah Agar Mc Conkey Koloni Koloni Isolat Murni Agar Nutrien Pewarnaan Gram (-) (+) Uji Oksidase (-) (+) Enterobacteriaceae Non-Enterobacteriaceae TSIA MRVP Urea Indol Sitrat Fermentasi Karbohidrat Coccus Batang Berspora Batang Tidak Berspora Uji Katalase (+) (-) Bacillus sp. Mycobacterium Corynebacterium Propionobacterium Lactobacillus Micrococcaceae Streptococcaceae Uji Mikroaerofilik (+) (-) Staphylococcus Micrococcus MSA (-) (+) Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Gambar 14 Diagram Alir Identifikasi Bakteri Sumber: Lay (1994)
Persiapan Bahan Contoh berupa insang dan organ saluran pencernaan (lambung dan usus) yang berasal dari ikan nila hitam diambil dan diberi perlakuan. Insang diletakan dalam cawan petri steril, dipotong kecil-kecil dan digerus dalam mortar untuk membebaskan bakteri dari tenunan insang. Digesta dari saluran pencernaan dimasukkan ke dalam mortar dan digerus. Aquades steril ditambahkan pada gerusan. Isolasi Bakteri Suspensi hasil gerusan ditanam di atas media agar darah dan agar Mac-Conkey untuk menumbuhkan koloni dengan teknik goresan T. Pengerjaan dilakukan secara steril. Media yang telah digores diinkubasi pada inkubator bersuhu 37 o C selama kurang lebih 24 jam. Koloni yang tumbuh pada agar darah dan agar Mac-Conkey diambil dan dilakukan karakterisasi berdasarkan persamaan morfologis, yaitu ukuran, warna, bentuk, tepi permukaan, dan transparansi. Koloni terpisah selanjutnya ditanam kembali pada agar nutrient dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Selanjutnya dari koloni yang tumbuh dilakukan pewarnaan Gram. Teknik pewarnaan Gram yaitu spesimen yang telah difiksasi ditetesi kristal violet dan didiamkan selama 1 menit kemudian dibilas dengan aquades. Spesimen selanjutnya dibilas dengan larutan pemucat (alkohol) selama 10-20 detik. Tahap terakhir ialah spesimen ditetesi safranin dan didiamkan selama 1 menit kemudian dibilas dengan aquades serta dikeringkan dengan kertas pengering. Koloni tersebut juga dipindahkan ke agar nutrien, kemudian diinkubasi pada inkubator bersuhu 37 o C selama 24 jam. Identifikasi Bakteri Koloni dengan hasil Gram positif yang berbentuk coccus selanjutnya diuji dengan uji katalase. Katalase adalah enzim yang mengkatalisiskan (H 2 O 2 ) menjadi air dan oksigen. Penentuan adanya katalase diuji dengan penambahan 3% H 2 O 2 pada koloni terpisah. Uji ini dilakukan untuk membedakan antara kelompok Staphylococcus dan Streptococcus (Lay 1994). Kelompok Streptococcus bersifat katalase negatif, sedangkan Staphylococcus bersifat katalase positif. Bakteri yang
bersifat katalase positif akan terlihat pembentukan gelembung udara di sekitar koloni. Reaksi kimiawai yang dikatalisasikan oleh enzim katalase terlihat berikut ini: Bakteri dengan sifat katalase positif selanjutnya dilakukan uji Manitol Salt Agar (MSA) yang mengandung kadar NaCl tinggi, sehingga akan menghambat pertumbuhan bakteri lain namun Staphylococcus tidak dihambat pertumbuhannya. Media ini terutama digunakan untuk membedakan kelompok Staphylococcus yang berifat patogen dan non-patogen. S. aureus pada umumnya bersifat patogen dan menghasilkan warna kuning pada agar. S. epidermidis bersifat tidak patogen dan membentuk zona merah pada agar. Warna kuning disebabkan oleh fermentasi manitol disertai pembentukan asam, sedangkan warna merah disebabkan manitol yang tidak difermentasikan. Bakteri yang bersifat Gram positif dengan bentuk batang terbagi menjadi dua, yaitu batang besar memiliki spora dapat diidentifikasi sebagai Bacillus sp., sedangkan batang yang tidak memiliki spora dapat termasuk bakteri Mycobacterium, Corynebacterium, Propionobacterium, dan Lactobacillus. Uji Oksidase berfungsi untuk menentukan adanya oksidase sitokrom pada mikroorganisme. Uji ini berguna dalam identifikasi mikroorganisme patogen seperti Neisseria gonorrhoea dan Pseudomonas aeruginosa yang menunjukkan hasil positif terhadap uji oksidase. Reagen uji oksidase terdiri dari 1:1 (vol/vol) laruran 1% alpha-naphtol dan 1% dimetil-p-fenillendiamin oksalat. Tahapan dalam uji oksidase ialah dengan pencampuran koloni terpisah dengan reagen. Hasil oksidase positif ditunjukkan dengan warna koloni yang berubah menjadi berwarna hitam setelah 30 menit. Hal ini disebabkan oksidase sitokrom mengoksidasikan larutan reagen (Lay 1994). Hasil positif uji oksidase dapat dilanjutkan dengan proses identifikasi menggunakan media Triple Sugar Iron Agar (TSIA), indol, Methyl Red-Voges proskauer (MRVP), sitrat, urea, uji fermentasi karbohidrat. Uji oksidase yang menunjukkan hasil negatif mengindikasikan jenis bakteri Pseudomonas dan Bordetella. Uji TSIA dilakukan dengan menggunakan Triple Sugar Iron Agar. Media mengandung tiga macam gula yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa, selain itu media
juga mengandung indikator merah fenol dan FeSO 4 untuk memperlihatkan pembentukan H 2 S yang ditunjukkan dengan adanya endapan hitam. Konsentrasi glukosa adalah 1/10 dari konsentrasi laktosa atau sukrosa agar fermentasi glukosa saja dapat terlihat. Media TSIA terdiri dari dua bagian yaitu butt (bawah) dan slant (atas). Tahapan uji TSIA yaitu koloni bakteri diambil dengan menggunakan needle, kemudian ditusukkan pada bagian tengah butt dan langsung dilanjutkan dengan penggoresan di bagian slant. Setelah itu media diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24-48 jam (Lay 1994). Reaksi yang dapat terlihat pada media TSIA adalah jika bagian butt bersifat asam dan berwarna kuning dan bagian slant bersifat basa dan berwarna merah,. hal ini menunjukkan adanya fermentasi glukosa. Jika pada keseluruhan media terjadi pembentukan asam sehingga seluruh media berwarna kuning, hal ini menunjukkan terjadi fermentasi laktosa atau sukrosa atau keduanya. Jika terbentuk gas, seperti H 2 dan CO 2, pada bagian butt media akan terpecah. Jika seluruh media berwarna merah hal ini berarti ketiga jenis gula tidak difermentasi. Jika terjadi pembentukan H 2 S, akan terlihat adanya endapan hitam pada butt (Lay 1994). Uji indol dilakukan dengan menggunakan media indol yang kaya akan triptofan. Isolat bakteri yang telah diambil dengan menggunakan needle ditusukkan ke bagian tengah media kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24-48 jam. Untuk melihat reaksi uji indol dilakukan dengan penambahan reagen Erlich-Bohme sebanyak 2-3 tetes dan ditunggu selama 2-3 menit. Hasil uji positif terlihat dengan terbentuknya warna merah pada permukaan media. Media indol berbentuk semi padat sehingga dapat digunakan untuk mengetahui pergerakan bakteri. Bakteri yang bersifat motil terlihat pertumbuhan koloni di sekitar tusukan dan dipermukaan media (Lay 1994). Uji Methyl Red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Fermentasi asam campuran ditentukan dengan cara menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu yang mengandung glukosa dan menambahkan reagens methyl red ke dalam kaldu setelah masa inkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Hasil positif ditunjukkan dengan kaldu biakan yang berubah menjadi kuning atau jingga jika tidak terjadi fermentasi asam campuran. Uji ini sangat
berguna dalam mengidentifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan. Uji Voges Proskauer digunakan untuk mengidentifikasi mikroorgnisme yang memfermentasi 2,3-butanadiol yang mengakibatkan penumpukan bahan dalam pertumbuhan. Penambahan 10 tetes 40% KOH dan 15 tetes 5% larutan alphanapthol dalam etanol dapat menentukan adanya asetoin (asetilmetilkarbinol), yaitu suatu senyawa pemuka dalam sintesis 2,3-butanadiol. Keberadaan asetoin ditunjukan oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Hasil reaksi dapat terlihat paling lambat setelah 30 menit. Perubahan warna kaldu biakan akan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara karena sebagian 2,3-butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi. Uji sitrat dilakukan dengan menggunakan media Simmon s citrate yang berbentuk padat dan berwarna hijau. Media merupakan medium sintetik dengan + Na sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, NH 4 sebagai sumber N dan brom thymol blue sebagai indikator ph. Koloni bakteri yang telah diambil dengan menggunakan ose kemudian digoreskan pada permukaan media dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24-48 jam. Hasil uji positif diperlihatkan dengan perubahan warna media dari warna hijau menjadi biru. Hal ini menunjukan kemampuan dari bakteri yang diuji dalam menggunakan sitrat dari media sebagai satu-satunya sumber karbon (Lay 1994). Uji urea dilakukan dengan menggunakan media urea yang berbentuk padat dan berwarna merah-jingga. Isolat bakteri yang telah diambil dengan menggunakan ose digoreskan pada permukaan media dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24-48 jam. Hasil uji positif terlihat dengan perubahan warna media dari merah-jingga menjadi merah-ungu. Hal ini terjadi karena terjadinya proses hidrolisis urea (Lay 1994). Uji fermentasi karbohidarat dilakukan dengan menggunakan media kaldu karbohidrat yaitu glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa dan manitol yang mengandung indikator brom cresol purple (BCP) dan di dalam tabung terdapat tabung Durham sebagai indikator pembentukan gas. Isolat bakteri yang telah diambil dengan menggunakan ose diinokulasi ke dalam media, kemudian
diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24-48 jam. Hasil positif uji fermentasi karbohidrat diperlihatkan perubahan ph (warna kuning). dan pembentukan gas yang terlihat dengan adanya gelembung gas pada tabung Durham (Lay 1994).