BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN Sistem kromatografi yang digunakan merupakan kromatografi fasa balik, yaitu polaritas fasa gerak lebih polar daripada fasa diam, dengan kolom C-18 (n-oktadesil silan) sebagai fasa diam. Dalam sistem ini analit yang lebih non polar akan tertahan lebih lama pada fasa diam sehingga akan keluar dari kolom lebih lama daripada analit lain yang lebih polar. TBHQ, BHA, BHT memiliki gugus kromofor, yaitu cincin aromatik dan gugus auksokrom sehingga dapat dideteksi dengan KCKT yang menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 280 nm. Kondisi optimum KCKT diperoleh pada sistem gradien dari campuran fasa gerak metanol : asetonitril : asam asetat 1% (Tabel 1) dan diperoleh pemisahan dengan resolusi (R) 1,5 dengan waktu analisis 12 menit. t (menit) Tabel 4.1 Sistem Elusi Gradien Metanol (%) Asetonitril (%) Asam asetat 1% (%) 0 60 20 20 1 6 60 25 15 1 9 60 30 10 1 11 60 30 10 1,2 12 60 20 20 1 Laju alir (ml/menit) Metanol dan asetonitril digunakan sebagai fasa gerak karena dapat mengelusi TBHQ, BHA, BHT dan merupakan pelarut polar yang umum digunakan dalam kromatografi fasa balik. Asam asetat berfungsi untuk mengendalikan keasaman sistem sehingga dapat menahan ionisasi analit. Sistem elusi gradien dipilih karena dapat memberikan pemisahan dengan resolusi yang baik dan puncak yang bagus (tidak berekor). 17
18 TBHQ BHA BHT Gambar 4.1 Larutan baku TBHQ, BHA, BHT Tabel 4.2 Resolusi Puncak Kromatogram TBHQ, BHA, BHT Antioksidan t R (menit) W Resolusi TBHQ 2,775 0,157 - BHA 4,126 0,191 7,764 BHT 10,701 0,224 31,687 Untuk mendapatkan hubungan antara konsentrasi antioksidan (dalam bpj) dengan respon dari alat berupa AUC (area under curve), dibuat kurva kalibrasi yang memplotkan konsentrasi antioksidan terhadap AUC. Koefisien korelasi (r) dari kurva kalibrasi yang diperoleh mendekati 1 dan nilai koefisien variasi fungsi regresi (V x0 ) < 5% (Tabel 3). Berarti dengan metode ini, alat KCKT dapat memberikan respon yang sebanding terhadap konsentrasi TBHQ, BHA, dan BHT (memiliki kelinieran yang baik). Dari perhitungan nilai t gawat diperoleh t hitung lebih besar dari t tabel (pada aras keberartian 0,05) maka H 0 ditolak, berarti ada korelasi yang signifikan antara nilai AUC dengan konsentrasi antioksidan.
19 AUC 200 150 100 50 0 Kurva Kalibrasi TBHQ 1,94 3,88 4,855,82 7,76 9,7 0 5 10 15 Konsentrasi (bpj) AUC 200 150 100 50 0 Kurva Kalibrasi BHA 2,05 4,1 5,126,15 8,2 10,24 0 5 10 15 Konsentrasi (bpj) AUC 100 80 60 40 20 0 Kurva Kalibrasi BHT 2,08 4,16 5,26,24 8,32 10,4 0 5 10 15 Konsentrasi (bpj) Gambar 4.2 Kurva kalibrasi TBHQ, BHA, BHT Tabel 4.3 Kelinieran Metode Antioksidan Hubungan Konsentrasi (bpj) dengan AUC r V x0 t hitung t tabel H 0 TBHQ y = 14,923x + 7,2424 0,9989 2,595 42,593 2,776 ditolak BHA y = 16,486x + 4,0659 0,9982 3,295 33,273 2,776 ditolak BHT y = 7,7698x + 12,119 0,9975 3,923 27,936 2,776 ditolak Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan. Batas kuantisasi adalah jumlah terkecil analit yang dapat ditetapkan secara kuantitatif dan masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Batas deteksi dan batas kuantisasi menunjukkan kepekaan metode dan diperoleh dari kurva kalibrasi melalui perhitungan secara statistika. Tabel 4.4 Kepekaan Metode Antioksidan Batas Deteksi (bpj) Batas Kuantisasi (bpj) TBHQ 0,99 3,02 BHA 0,65 1,97 BHT 0,78 2,38
20 Kecermatan metode ditentukan dengan metode simulasi (spiked-placebo method). Dalam metode simulasi, sejumlah antioksidan yang telah dilarutkan dalam minyak ditambahkan ke dalam campuran matriks mie kemudian campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar antioksidan yang ditambahkan. Antioksidan diekstraksi dari mie dengan etil asetat karena pelarut tersebut dapat melarutkan TBHQ, BHA, dan BHT. Etil asetat diuapkan seluruhnya dan residunya direkonstitusi dengan metanol karena etil asetat tidak dapat bercampur dengan fasa gerak sehingga bila ekstrak etil asetat langsung disuntikkan ke dalam alat KCKT akan tertahan di kolom (fasa diam). Kecermatan ditunjukkan oleh perolehan kembali, yaitu untuk TBHQ 93,8-98,3%; BHA 87,2-98,3%; dan BHT 76,2-92,3%. Tabel 4.5 Kecermatan Metode TBHQ BHA BHT Konsentrasi* (bpj) Perolehan Kembali (%) Konsentrasi* (bpj) Perolehan Kembali (%) Konsentrasi* (bpj) Perolehan Kembali (%) 2,70 96,94 ± 7,76 3,00 98,33 ± 9,57 2,70 76,19 ± 10,87 4,95 98,32 ± 12,02 5,50 90,22 ± 8,90 4,95 90,87 ± 15,02 7,20 93,81 ± 2,56 8,00 87,20 ± 5,90 7,20 92,27 ± 5,60 Rentang 93,8-98,3 Rentang 87,2-98,3 Rentang 76,2-92,3 * Konsentrasi antioksidan hasil ekstraksi (pengenceran 10 kali dari konsentrasi dalam mie) TBHQ BHA BHT Gambar 4.3 Hasil analisis mie simulasi
21 Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Keseksamaan yang dilakukan adalah keseksamaan intra-day yang dilakukan dalam satu hari dan keseksamaan inter-day yang dilakukan dalam tiga hari yang berbeda dengan larutan baku antioksidan yang baru setiap harinya karena larutan antioksidan tidak stabil bila disimpan lebih dari 2 hari. Tujuan penentuan keseksamaan adalah untuk melihat kinerja alat dan metode analisis yang digunakan. Kriteria yang harus dipenuhi (menurut Horwitz) adalah nilai koefisien variasi tidak lebih dari 2 (1-0,5 logc), dengan C adalah konsentrasi analit dalam fraksi desimal. Kriteria lain untuk keseksamaan adalah nilai F, yaitu F hitung < F tabel yang berarti antara hasil pengukuran hari pertama, kedua, dan ketiga tidak ada perbedaan berarti. Tabel 4.6 Keseksamaan Intra-day Antioksidan Konsentrasi (bpj) AUC Rata-rata KV (%) Batas KV (%) TBHQ 4,85 75,52 ± 1,92 2,43 12,61 BHA 5,12 81,68 ± 1,94 2,26 12,51 BHT 5,20 51,1 ± 0,40 0,74 12,48 Tabel 4.7 Keseksamaan Inter-day TBHQ Konsentrasi AUC (bpj) Rata-rata KV (%) Batas KV (%) F hitung F tabel 4,85 81,70 ± 4,88 7,77 12,61 2,34 9,28 7,76 126,51 ± 3,89 4,00 11,75 2,11 9,28 9,70 159,42 ± 6,92 5,65 11,37 2,52 9,28 Tabel 4.8 Keseksamaan Inter-day BHA Konsentrasi AUC (bpj) Rata-rata KV (%) Batas KV (%) F hitung F tabel 5,12 bpj 86,02 ± 3,16 4,79 12,51 1,79 9,28 8,20 bpj 136,71 ± 4,10 3,90 11,66 2,01 9,28 10,24 bpj 174,32 ± 13,83 10,32 11,27 2,60 9,28
22 Tabel 4.9 Keseksamaan Inter-day BHT Konsentrasi AUC (bpj) Rata-rata KV (%) Batas KV (%) F hitung F tabel 5,20 bpj 54,63 ± 4,24 10,1 12,48 1,99 9,28 8,32 bpj 86,07 ± 5,17 7,81 11,63 2,59 9,28 10,40 bpj 107,11 ± 8,44 10,25 11,25 2,93 9,28 Penetapan kadar antioksidan dalam sampel mie instan di pasaran diperoleh hanya TBHQ yang terdeteksi dengan kadar rata-rata 1,35 µg per gram mie instan. Setelah dikonversi terhadap perolehan kembali TBHQ, yaitu 93,8-98,3% maka diperoleh kadar TBHQ dalam mie instan adalah 1,37-1,44 µg per gram mie instan. TBHQ Gambar 4.4 Hasil analisis sampel mie instan Walaupun hanya TBHQ yang terdeteksi tidak berarti dalam minyak yang digunakan untuk menggoreng mie instan tidak terdapat antioksidan lain, tetapi karena TBHQ memiliki ketahanan yang baik terhadap penggorengan pada suhu tinggi maka TBHQ dapat terdeteksi pada produk akhir makanan.
23 Tabel 4.10 Penetapan Kadar Sampel Mie Instan Pengukuran Kadar TBHQ (µg/g mie) 1 1,47 2 1,44 3 1,22 4 1,30 5 1,36 6 1,28 Rata-rata 1,35 KV (%) 7,21