BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan termasuk penelitian deskriptif. Penelitian deskriptif adalah metode penelitian yang bertujuan membuat gambaran secara sistematis, faktual dan akurat mengenai fakta, sifat serta hubungan antar fenomena yang diselidiki, sehingga metode ini berkehendak untuk mengadakan akumulasi data dasar semata (Nazir, 1998). B. Objek Penelitian Sampel DNA indukan Osphronemous gouramy yang berasal dari dua kota yang berbeda, masing-msing 10 gurame indukan Sukabumi dan 10 gurame indukan Tasikmalaya. C. Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilakukan sejak bulan Maret 2010 sampai Juli 2010 di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Pendidikan Biologi, Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Indonesia. D. Alat dan Bahan yang digunakan Alat dan bahan yang digunakan mencakup alat dan bahan yang digunakan dalam isolasi DNA, eleltroforesis dan polymerase chain reaction. Adapun Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada tabel 3.1 dan tabel 3.2. 20

21 Tabel 3.1 Alat yang digunakan No. Alat Fungsi 1. Tabung mikrosentrifuga 1,5 ml Menyimpan hasil isolasi DNA 2. Lemari es/freezer Menyimpan sampel, bahan isolasi dan bahan PCR 3. Mikropipet dan tips Mengambil larutan 4. Pisau bedah dan pinset Mengambil sulur ikan 5. Botol duran Menyimpan larutan 6. Waterbath Menginkubasi saat melakukan isolasi DNA 7. Mikrosentrifuga Memisahkan molekul menurut berat jenis 8. Mini spin Menghomogenkan bahanbahan PCR 9. Spatula Mengambil bahan padatan 10. Microwave Menghomogenkan agarosa 11. Horizontal electrophoresis Elektroforesis hasil isolasi dan hasil PCR 12. Timbangan digital Menimbang bahan 13. Tray dan Comb Mencetak agarosa 14. UV-transillumeter Melihat hasil elektroforesis 15. Mesin PCR Perbanyakan potongan DNA 16. Gloves Mengurangi kontaminasi dari tangan 17. Kamera digital Alat dokumentasi hasil isolasi dan hasil PCR Tabel 3.2 Bahan yang Digunakan No. Bahan Fungsi 1. Es batu Mempertahankan suhu sampel tetap dingin 2. Air deion Pelarut yang tidak mengandung ion 3. Primer DNA Faktor inisiasi dalam PCR 4. MgCl 2 Kofaktor dalam proses PCR 5. Buffer taq DNA polymerase Menjaga kondisi optimal dari taq polymerase 6. dntps Bahan nukleotida dalam PCR 7. Taq polymerase (merek Enzim dalam proses PCR Fermentas) 8. Larutan TBE dan TAE Buffer dalam proses elektroforesis untuk menjaga pergerakan DNA saat elektroforesis

22 9. Gel agarosa Media untuk mengelektroforesis 10. Buffer lisis 2x CTAB Menghancurkan membran sel 11. Sodium dodecyl sulfate (SDS) 20% Melarutkan lemak, mendenaturasi protein 12. Proteinase K Memutuskan rantai polipeptida protein 13. Potasium asetat 5M Mengendapkan protein yang terdenaturasi 14. CIAA (Chlorofom Isoamyl alcohol) Melarutkan protein, mengikat lemak 15. RNAse Mendegradasi molekul RNA 16. Sodium asetat 3M Mengendapkan protein 17. Etanol absolute Mengendapkan asam nukleat 18. Alkohol 70% Memisahkan garam-garam yang menempel pada DNA 19. Buffer TE (Tris-EDTA) Pelarut DNA 20. Loading dye Pelarut DNA saat elektroforesis 21. DNA marker Standar ukuran DNA 22. Ethidium Bromide Pewarna DNA yang dapat berpendar bila diberi sinar UV E. Cara Kerja 1. Persiapan alat dan bahan Sebelum melakukan penelitian, dilakukan persiapan alat dan bahan yang akan digunakan. Persiapan meliputi pengecekkan bahan-bahan yang akan digunakan, pencucian botol-botol duran, pembuatan stok larutan bahanbahan yang akan digunakan ketika isolasi DNA maupun elektroforesis, sterilisasi tabung mikrosentrifuga 1,5 ml, tabung PCR, tips dan air deion, kalibrasi mikropipet dan penataan letak bahan-bahan baik dalam lemari maupun di dalam freezer.

23 2. Isolasi DNA Sampel indukan gurame yang digunakan berasal dari koleksi indukan Balai Perikanan Air Tawar Sukabumi. Sampel ikan disimpan pada wadah sterofoam yang berisi es dan disiapkan pisau, pinset dan gunting yang sebelumnya telah diberi alkohol 70% untuk mencegah kontaminasi mikroba. Kemudian diambil bagian sulurnya sebanyak ±2 cm kemudian sulur tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikrosentifuga steril ukuran 1,5 ml yang telah diberi tanda nama sampel baik Sukabumi maupun Tasikmalaya. Kemudiaan dimasukkan buffer lysis CTAB 2x fresh sebanyak 500 µl dan SDS 20% sebanyak 7 µl ke dalam tiap tabung mikrosentrifuga. Semua bahan dalam tabung dihomogenkan (dibolak-balik) minimal 50 x lalu diinkubasi pada suhu 65 o C selama 1 jam. Setelah itu, enzim proteinase K sebanyak 10 µl dimasukkan lalu dihomogenkan terlebih dahulu lalu diinkubasi kembali pada suhu 65 o C selama 2 jam. Selanjutnya dimasukkan kembali proteinase K sebanyak 5 µl lalu dihomogenkan dan diinkubasi kembali pada 65 o C selama 16 jam. Untuk mencegah penurunan air yang banyak, waterbath ditutup dengan menggunakan wadah plastik yang kurang lebih seukuran dengan waterbath. Setelah diinkubasi selama semalam kemudian potassium asetat 5 M ditambahkan ke dalam tabung sebanyak 1/10 volume dan diinkubasi dalam freezer selama 20 menit. Tabung disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit dan fasa cair bagian atas (supernatan) yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifuga baru. Enzim RNAse ditambahkan ke dalam tabung tersebut sebanyak 1/100 volume dan diinkubasi pada 37 o C selama 1 jam. Kemudian,

24 kloroform : isoamil alkohol (24 : 1) sebanyak ½ volume dimasukkan ke dalam tabung dan dihomogenkan dengan cara dibolak-balik minimal sebanyak 50 x. Tabung disentrifuga kembali pada kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit. Fasa bagian atas dipindahkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga baru yang steril dan sodium asetat 3 M sebanyak 1/10 volume ditambahkan lalu dihomogenkan. Setelah itu, etanol absolut dingin sebanyak 2 x volume ditambahkan dan dihomogenkan kemudian diinkubasi dalam freezer suhu -20 o C selama semalam. Setelah semalam, tabung disentrifuga kembali pada kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit lalu etanol absolut dalam tabung mikrosentrifuga tersebut dibuang. Tabung mikrosentrifuga dibilas dengan alkohol 70% sebanyak 1x volume. Kemudian bagian dalam tabung dikeringkan secara alami dengan membalikkan tabung diatas kertas tissue. Setelah DNA kering, sebanyak 30-50 µl TE ditambahkan ke dalam tabung. Tabung diinkubasi pada suhu 37 o C selama 15 menit dan simpan dalam freezer sebagai DNA stok untuk selanjutnya dilakukan elektroforsesis DNA hasil isolasi. 3. Elektroforesis DNA Hasil Isolasi Sebanyak 20 tabung mikrosentrifuga yang berisi DNA stok sampel Sukabumi dan Tasikmalaya dipersiapkan di dalam wadah sterofoam berisi es. Konsentrasi gel agarosa 1% sebanyak 0,25 gram dilarutkan dalam buffer 1 x TAE dengan menggunakan alat microwave selama ±3 menit. Gel yang telah cair didinginkan terlebih dahulu pada suhu kamar kemudian pada

25 keadaan hangat-hangat kuku gel dituangkan ke dalam cetakan bersisir secara merata dan didiamkan hingga membeku. Setelah gel membeku, kemudian disimpan dalam alat elektroforesis hingga terendam seluruhnya oleh buffer 1x TAE. DNA dalam tabung mikrosentrifuga kemudian diambil sebanyak 5 µl dan dicampurkan dengan 2 µl Loading dye diatas parafilm hingga benar-benar homogen. Dengan hati-hati DNA yang telah dicampur Loading dye dimasukkan ke dalam sumur gel. Selanjutnya gel dielektroforesis selama 30 menit pada tegangan 100 volt. Setelah elektroforesis selesai, dilakukan pewarnaan dengan merendam gel selama 5 menit dalam larutan Etidium Bromida dan dibilas dengan air deion steril selama 3 menit. Selanjutnya, hasil elektroforesis diamati pada UV- Transiluminator (520 nm) dan didokumentasikan dengan kamera digital Nikkon cool-pix 2200. 4. Amplifikasi dengan RAPD Dilakukan PCR terhadap DNA sampel dan kontrol. Amplifikasi menggunakan dua primer yaitu OPA2 dan OPA20. Suhu annealing yang digunakan sesuai dengan penelitian Holipah (2006) yaitu 35 o C. Adapun komposisi reaksi PCR yang digunakan terlihat pada Tabel 3.3 dan tahapan siklus amplifikasi dapat dilihat pada Gambar 3.1.

26 Tabel 3.3 Komposisi Reaksi PCR RAPD Reagen Konsentrasi stok Konsentrasi Akhir Volume 1 reaksi (µl) Volume ½ reaksi (µl) Air deion steril 16,1 8,05 MgCl 2 25 mm 2 mm 2 1 Buffer taq polymerase * 10 X 1 X 2,5 1,25 dntp 100 mm masingmasing 200 mm untuk 0,2 0,1 datp, masing-masing dgtp, dctp, dttp datp, dgtp, dctp, dttp Taq Polymerase 5U/ µl 1 U/ µl 0,2 0,1 DNA 2 1 Primer 32 ng/ µl 32 ng 2 2 *Telah mengandung 2 mm MgCl 2 maka total konsentrasi akhir MgCl 2 dalam reaksi tersebut sebesar 4 mm. Denaturasi Annealing Extension Inkubasi 94 o C 94 o C 72 o C 72 o C 2 35 o C 2 5 10 o C 1 35 siklus Gambar 3.1 Tahapan dan Suhu PCR Primer RAPD 5. Elektroforesis DNA Hasil PCR Untuk mengetahui hasil PCR dengan penanda RAPD, dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarosa 2% (0,50 gram) yang dilarutkan dalam 25 ml buffer 0,5x TBE. Sebanyak 5 µl DNA dari tabung PCR diambil dan dihomogenkan dengan 2 µl Loading dye kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa dengan hati-hati. Elektroforesis

27 dilakukan selama 120 menit dengan tegangan 50 volt menggunakan alat elektroforesis horizontal. Untuk mengetahui ukuran fragmen-fragmen DNA yang muncul digunakan marker 100 pb DNA mix ladder (merek Gene ruler TM ) sebanyak 3 µl. Setelah elektroforesis selesai dilakukan, kemudian dilakukan pewarnaan dengan menggunakan etidium bromida selama 5 menit diatas alat shaker dan dicuci dengan air deion selama 3 menit dalam keadaan digoyang-goyangkan. Hasil pewarnaan dilihat dalam UV-transilumeter (λ=520 nm) dan didokumentasikan dengan menggunakan kamera digital Nikkon cool-pix 2200.

28 6. Analisis Data Analisis data dilakukan berdasarkan pola larik DNA pada gel agarosa. Proporsi larik DNA dihitung untuk masing-masing primer. Pada penelitian ini, larik yang dianalisis adalah larik yang hadir dan jelas terlihat oleh mata, tanpa memperhitungkan intensitasnya. Selanjutnya larik DNA hasil elektroforesis diinterpretasikan menjadi angka satu (1) untuk kehadiran larik dan angka nol (0) untuk ketidakhadiran larik. Data matriks tersebut dianalisis untuk mencari nilai heterozigositas dan koefisien kesamaan genetik. Koefisien kesamaan yang digunakan untuk menguji pasangan objek yang dibandingkan sesuai koefisien Nei dan Li (1979). Rumus kesamaan Nei dan Li : S xy = 2N xy /N x +N y Keterangan : S xy = Koefisien kesamaan genetik n xy = JumLah larik yang dihasilkan oleh individu x dan y n x = JumLah larik yang dihasilkan oleh individu x n y = JumLah larik yang dihasilkan oleh individu y Data hasil perhitungan koefisien kesamaan tersebut, dikonstruksi dendogram dengan metode klaster Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averages (UPGMA) menggunakan software MVSP 3.1 (Multivariate Statistical Package Ver. 3.1. ). Setelah itu, dilakukan perhitungan nilai heterozigositas menurut Lynch & Milligan (1994). Rumus heterozigositas pada lokus i adalah : H (i) = 2q(i)[1-q(i)]+2 var[q(i)]

29 Keterangan: q(i) = nilai frekuensi dan heterozigositas dari populasi Var [q(i)] = [1-x(i)], dengan N adalah jumlah sampel 4N Adapun untuk menghitung nilai q(i) tersebut adalah: q(i) = x (i) 1- Var[x(i)] -1 8[x(i)]2 Keterangan: x (i) = frekuensi homozigot resesif null pada lokus i, dan Var [x(i)] = [1-x(i)], dengan N adalah jumlah sampel N Setelah itu, dilakukan perhitungan nilai PIC Polymorphism Information Content menurut Botsein et al 1980 dalam Rizasti (2010) dengan persamaan: PIC = 1 Σ pi 2 -( Σ Pi i) 2 + Σ pi 2 Keterangan: pi adalah frekuensi alel ke-i.

30 7. Alur Penelitian Studi pustaka Pembuatan proposal Persiapan alat dan bahan Isolasi DNA gurame sampel Isolasi DNA gurame kontrol Elektroforesis DNA hasil isolasi PCR dengan primer RAPD Elektroforesis hasil PCR dengan agaroa 2% Hasil PCR DNA indukan sampel Hasil PCR DNA kontrol Analisis data Gambar 3.2. Alur Penelitian