III. METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian 1.1. Peralatan Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol sampel, beaker glass, cool box, labu Erlenmayer, tabung reaksi, gelas ukur, sarung tangan karet, masker, alumunium foil, tabung mikrosentrifuge 1,5 ml, tabung disposable 50 ml, hot plate dan stirrer, vorteks, kertas parafilm, timbangan analitik, autoklaf, mikropipet 100-1000 µl, mikropipet 20-200 µl, mikropipet 0,5-10 µl, tip biru, tip kuning, tip putih, ph indicator strip, waterbath, nanospektrofotometri, alat elektroforesis, UV transiluminator, PCR tube 0,2 ml, perangkat PCR dan perangkat elektroforesis DGGE. 1.2. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuades steril, sampel sedimen dari lahan mangrove, buffer Tris-HCl, asam asetat glasial, ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), FeCl 3, sodium dodecyl sulphate (SDS), kloroform, isoamyl alcohol, alkohol absolut, alkohol 70%, NaCl, agarosa, Marka DNA 100 bp, DNA fluorosafe, ethidium bromide (EtBr), PCR primer universal 16S rrna 27F (AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG) dan 1540R (AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA) (Gurtner et al., 2000), PCR pimer universal 16S rrna 968F-GC (5 -CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3 ) dan 1406R (5 ACG GGC GGT GTG TAC 3 ) (Nakatsu et al., 2000), akuabides, Kappa PCR Master Mix, akrilamid, bis-akrilamid, UREA, formamide, tetramethylethylenediamine (TEMED), ammonium persulfat, Biorad Dye Solution dan loading dye. 2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan dengan pengambilan sampel sedimen tanah di lahan mangrove Tritih Kulon Cilacap. Ekstraksi DNA dilaksanakan di 6
Laboratorium Biologi Molekuler Universitas Jenderal Soedirman, amplifikasi DNA dilaksanakan di Laboratorium Riset Terpadu Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto, dan elektroforesis DGGE dilakukan di Laboratorium Biosains Universitas Brawijaya Malang selama bulan Februari November 2014. B. Metode Penelitian 1. Metode Percobaan Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif dengan tahapan ektraksi DNA bakteri sedimen mangrove, amplifikasi DNA dengan PCR, dan analisis DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). 2. Bagan Alir Penelitian Sampel Sedimen Mangrove Isolasi DNA dari Sedimen Mangrove Verifikasi Elektroforesis Gel Agarosa 1,5% Spektrofotometri Rasio A260/280 Rasio A260/230 Amplifikasi Gen Penyandi 16S rrna Menggunakan Primer 27F dan 1540R Elektroforesis Gel Agarosa 1,5% Amplifikasi Gen Penyandi 16S rrna Menggunakan Primer 968F-GC dan 1406R Elektroforesis Gel Agarosa 1,5% Analisis Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Data Diversitas Bakteri Sedimen Mangrove Tritih Kulon 7
3. Cara Kerja 3.1. Preparasi Sampel Tanah Sampel sedimen tanah diambil dari lahan mangrove Tritih Kulon Cilacap. Sampel sedimen tanah diambil dengan teknik random sampling. Sebelum pengambilan, ph sedimen tanah diukur terlebih dahulu dengan menggunakan ph meter. Pengambilan sampel sedimen tanah dilakukan dari permukaan sampai kedalaman 15 cm dari permukaan sedimen. Sampling dilakukan pada 3 titik yang berbeda, kemudian sampel dari 3 titik tersebut dikompositkan. Setelah itu sampel dimasukan ke dalam plastik dan disimpan dalam cool box. 3.2. Ektraksi DNA dari Sampel Sedimen Tanah (More, 2011 dengan modifikasi) Sampel sedimen mangrove sebanyak 1 gram dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Sampel ditambahkan dengan 400 µl FeCl 3 200 mm dan divorteks selama 10 detik. Pasir steril 1 gram dan 1,5 ml SDS 20% ditambahkan ke dalam campuran kemudian divorteks selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Campuran diinkubasi selama 45 menit pada suhu 75 o C. Campuran yang telah diinkubasi dipindahkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml diikuti dengan proses sentrifugasi 15700 g selama 12 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru kemudian NaCl 2 M ditambahkan sebanyak setengah volume supernatan. Campuran disentrifugasi 15700 g selama 12 menit. Natan yang diperoleh ditambahkan dengan TE 1X 700 µl. Larutan kloroform : isoamil alkohol (24:1) ditambahkan dengan volume yang sama kemudian disentrifugasi 15700 g selama 12 menit pada suhu 4 o C. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru dan ditambahkan etanol absolut dengan volume yang sama diikuti dengan proses sentrifugasi 15700 g selama 12 menit pada suhu 4 o C. Natan yang diperoleh dicuci dengan etanol 70% dingin sebanyak 1 ml dan disentrifugasi kembali dengan 9300 g selama 5 menit pada suhu 4 o C. Supernatan dibuang dan dikering anginkan selama 10 menit, kemudian dipreservasi dengan TE 1X 100 µl. Keberhasilan isolasi 8
DNA diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% pada voltase 100 V, 400 ma selama 50 menit. Kemudian divisualisasi dengan UV transiluminator. Kemurnian DNA diukur menggunakan spektrofotometri untuk memperoleh nilai rasio A260/280 dan A260/230. 3.3. Amplifikasi gen penyandi 16S rrna Amplifikasi 16S rrna dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Proses amplifikasi dilakukan sebanyak 2 tahapan. Tahap pertama menggunakan primer 27F dan 1540R dimulai dengan membuat campuran 8 µl ddh 2 O, 10 µl Kappa PCR Master Mix, 0,5 µl forward primer 10 µm, 0,5 µl reverse primer 10 µm, dan 1 µl template berupa DNA hasil isolasi. PCR tahap pertama dilakukan dengan tahapan pre-denaturasi 95 0 C selama 5 menit, denaturasi 94 0 C selama 1 menit, annealing 50 0 C selama 1 menit dan ekstensi 72 0 C selama 2 menit. Running PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dan final extention 72 0 C selama 10 menit. Kemudian suhu diturunkan 4 0 C selama 20 menit. Tahapan kedua menggunakan primer 968F-GC dan 1406R dilakukan dengan mencampurkan 8 µl ddh 2 O, 10 µl Kappa PCR Master Mix, 0,5 µl forward primer 10 µm, 0,5 µl reverse primer 10 µm, dan 1 µl template berupa hasil PCR tahap pertama. PCR tahap kedua dilakukan dengan tahapan pre-denaturasi 95 0 C selama 5 menit, denaturasi 94 0 C selama 1 menit, annealing 56 0 C selama 1 menit dan ekstensi 72 0 C selama 2 menit. Running PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dan final extention 72 0 C selama 10 menit. Kemudian suhu diturunkan 4 0 C selama 20 menit. Keberhasilan amplifikasi diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% pada voltase 100 V, 400 ma selama 50 menit. Kemudian divisualisasi dengan UV transiluminator. 3.4. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Produk PCR tahap kedua sebanyak 15 µl dicampurkan dengan 5 µl loading dye. Campuran dimasukkan ke dalam sumuran gel poliakrilamid 8% yang direndam dalam larutan TAE 1X. Denaturing 9
gradient yang digunakan adalah 25% sampai 60% (pembuatan denaturant 100% mengandung urea 4 M dan 40% formamide). Elektroforesis dilakukan pada voltase 130 V pada suhu 60 o C selama 5,5 jam. Setelah elektroforesis, gel diinkubasi selama 15 menit pada etidium bromida 0,1%. Kemudian dibilas dengan TAE 1X selama 20 menit dan divisualisasi dengan UV transiluminator. C. Metode Analisis Pengamatan diversitas bakteri asal sedimen mangrove Tritih Kulon dilakukan dengan menganalisis profil Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). 10