II. MATERI DAN METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian A.1. Materi Penelitian A.1.1. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian adalah 4 isolat Trichoderma spp. koleksi Prof. Loekas Soesanto, Ph.D dari Laboratorium Hama dan Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian Universitas Jenderal Soedirman (isolat Trichoderma 1 diisolasi dari rhizosfer tanaman jahe, isolat Trichoderma 2 diisolasi dari rhizosfer tanaman nanas, isolat Trichoderma 3 diisolasi dari rhizosfer tanaman pisang, isolat Trichoderma 4 diisolasi dari rhizosfer tanaman bawang merah), sampel limbah minyak bumi yang berasal dari minyak pelumas bekas kendaraan bermotor, NaOH, HCl, media PDA, media MSM, glukosa, larutan tween 80, akuades steril, spirtus, alkohol 70%, dan pelarut dietil eter. A.1.2. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah cawan petri, cawan porselen, tabung reaksi, beaker glass 1000 ml, labu erlenmeyer 250 ml, gelas ukur 250 ml, corong pisah, cover glass, haemositometer, jarum ose, pinset, pipet tetes, pipet ukur, kertas saring, blue tip, yellow tip, bunsen, sprayer, rak tabung reaksi, pisau, alumunium foil, kapas, kertas label, wrapper, ph meter, termometer, shaker incubator, oven, dessicator, timbangan analitik (Explorer Ohaus USA), autoklaf, mikropipet, mikroskop, setrifugasator, vortex, vaccum pump, magnetic stirrer, hot plate dan Laminar Air Flow. A.2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikologi dan Fitopatologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto. Penelitian dilakukan pada bulan Januari 2014 sampai Februari 2014. 5
B. Metode Penelitian B.1. Rancangan Percobaan Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental dengan rancangan percobaan berupa Rancangan Acak Lengkap (RAL). Penelitian ini terdiri dari 5 perlakuan. Perlakuan yang dicobakan, yaitu: K : Limbah minyak pelumas tanpa isolat Trichoderma spp. T j : Limbah minyak pelumas dengan isolat Trichoderma 1 T n : Limbah minyak pelumas dengan isolat Trichoderma 2 T p : Limbah minyak pelumas dengan isolat Trichoderma 3 T b : Limbah minyak pelumas dengan isolat Trichoderma 4 Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 5 kali sehingga terdapat 25 unit perlakuan. B.2. Variabel Penelitian Variabel yang diamati berupa variabel bebas dan tergantung. Variabel bebas adalah isolat Trichoderma spp. Variabel tergantung adalah pertumbuhan isolat Trichoderma spp. dan persentase penurunan kadar minyak pada limbah minyak pelumas. Parameter yang diukur, yaitu parameter utama dan paremeter pendukung. Parameter utama yang diamati terdiri dari TPH dan bobot kering miselium isolat Trichoderma spp. Sedangkan parameter pendukungnya adalah biosurfaktan, ph pada awal dan akhir perlakuan. B.3 Cara Kerja B.3.1. Sterilisasi alat dan bahan (Davet dan Rouxel, 1997) Alat-alat berbahan gelas yang akan digunakan disterilisasi terlebih dahulu. Sterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121 o C, tekanan 2 atm selama 15 menit. Alat-alat yang berbahan logam dapat disterilisasi dengan alkohol 70% dan bunsen. B.3.2. Pembuatan media PDA (Potato Dextrose Agar) (Sudarmaji et al., 1984) Pembuatan medium PDA pada Lampiran 1. 6
B.3.3. Pembuatan media MSM (Mineral Salt Medium) (Mills et al., 1978) (Modifikasi) Pembuatan medium MSM pada Lampiran 2. B.3.4. Peremajaan isolat Trichoderma spp. (Jayanti et al., 2013) Isolat Trichoderma spp. yang akan digunakan, diambil sebanyak 1 plug dari isolat murni dan diinokulasikan aseptis pada media cawan PDA (Potato Dextro Agar) secara berulang sampai tiga kali dalam kondisi aseptis. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 7-10 hari. B.3.5. Pembuatan suspensi Trichoderma spp. (Hamzah et al., 2012) (Modifikasi) Kultur hasil peremajaan isolat jamur Trichoderma spp. ditumbuhkan pada media miring PDA yang akan disiapkan dalam pembuatan suspensi spora. Masing-masing kultur hari ke-3 ditambahkan 10 ml akuades steril dan 0.1 ml larutan tween 80 untuk memisahkan spora dari miselium. Kultur tersebut dihomogenkan menggunakan vortex hingga spora terlepas dan tampak larut di dalam larutan. B.3.6. Perhitungan kepadatan spora suspensi Trichoderma spp. (Tarman, 2006) (Modifikasi) Kepadatan spora dihitung menggunakan hemasitometer hingga mendapatkan konsentrasi konsentrasi spora sekitar 10 5 spora/ml. Spora kapang yang dihitung yaitu pada sel yang terletak di atas dan kiri menyentuh garis tengah pada tepi bujur sangkar dengan bantuan mikroskop. Perhitungan jumlah spora berdasarkan rumus: Jumlah spora = (t x d) x 10 5 (2-1) (n x 0.25) d :Tingkat pengenceran t : Jumlah total spora kapang dalam kotak sampel besar yang diamati n : Jumlah kotak sampel (5 kotak besar x 16 kotak kecil) 0.25 : Faktor koreksi penggunaan kotak sampel skala kecil haemositometer B.3.7. Pembuatan inokulum Trichoderma spp. (Hamzah et al., 2012) Suspensi Trichoderma spp. sebanyak 10 ml ditambahkan pada labu erlenmeyer berisi media MSM 100 ml dan 3% glukosa dan diinkubasi pada suhu 30 o C pada shaker inkubator dengan kecepatan 180 rpm selama 2 hari. 7
B.3.8. Uji kemampuan isolat Trichoderma spp. pada media MSM yang mengandung limbah minyak pelumas (Hamzah et al., 2012) Sebanyak 10 ml suspensi Trichoderma spp. dari media MSM tanpa limbah minyak pelumas diinokulasikan ke dalam 100 ml media MSM yang telah ditambahkan limbah minyak pelumas secara aseptis. Penambahan limbah minyak pelumas tersebut masing-masing dengan konsentrasi 1% (v/v). Setelah itu dilakukan agitasi menggunakan shaker inkubator berkecepatan 200 rpm selama 9 hari pada suhu ruang. B.3.9. Perhitungan persentase penurunan kadar minyak dengan metode gravimetri (Mahmudah, 2009) Modifikasi Kultur hasil kultivasi yang telah diinkubasi selama 9 hari dipindahkan ke corong pisah dan ditambahkan 25 ml pelarut dietil eter. Setelah itu, larutan dikocok selama 2 menit dan didiamkan hingga terdapat 2 lapisan yaitu lapisan pelarut dietil eter yang berada di atas dan lapisan media yang berada di bawahnya. Lapisan media dikeluarkan dengan cara membuka keran pengatur pada corong pisah secara perlahan kemudian ditampung pada labu erlenmeyer. Setelah lapisan media dikeluarkan, lapisan pelarut dietil eter yang berisi minyak dituangkan pada cawan porselen yang sebelumnya sudah dioven hingga konstan dan ditimbang beratnya. Kadar minyak akhir atau TPH pada media yang mengandung limbah minyak pelumas dihitung menggunakan rumus sebagai berikut: (2-2) A : Berat cawan porselen + ekstrak minyak (g) B : Berat cawan porselen kosong (g) Sedangkan penurunan kadar minyak dihitung menggunakan rumus sebagai berikut: (2-3) A : Kadar minyak awal (kontrol) (g/l) B : Kadar minyak akhir (g/l) 8
B.3.10. Pengukuran bobot kering miselium akhir (Hamzah et al., 2012) Produksi bobot kering miselium dapat diketahui dengan filtrasi menggunakan kertas saring yang dikeringkan dan ditimbang terlebih dahulu. Endapan yang terdapat pada kertas saring merupakan kumpulan miselium. Kumpulan miselium pada kertas saring tersebut dicuci dengan 20 ml pelarut dietil ether untuk menghilangkan sisa minyak dan dikeringkan pada oven 80 o C selama 1x24 jam. Setelah itu didinginkan pada desiccator selama 10 hingga 20 menit dan ditimbang. Angka yang didapat dari penimbangan kertas saring dan miselium kering dihitung dengan rumus sebagai berikut: Bobot kering miselium akhir = A B (2-4) A : Berat kertas saring perlakuan B : Berat kertas saring tanpa perlakuan B.3.11. Pengukuran ph media (SNI-06-6989.11-2004, 2004) Nilai ph pada media diukur pada hari ke-0 dan hari ke-9 dengan menggunakan ph meter yang telah dikalibrasi. ph media diukur pada saat sebelum dan sesudah perlakuan. Elektroda dikeringkan menggunakan tissue kemudian dicelupkan ke dalam akuades dan dikeringkan kembali menggunakan tissue. Pengukuran ph dilakukan dengan mencelupkan elektroda pada media perlakuan hingga menunjukkan nilai konstan. B.3.12. Uji biosurfaktan pada isolat Trichoderma dengan metode oil spreading technique (Youssef et al, 2004) Uji biosurfakatan ini menggunakan hasil supernatan dari Isolat Trichoderma spp. dengan metode oil spreading technique. Supernatan hasil inkubasi selama 9 hari disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm. Supernatan tersebut diambil 20 µl diteteskan pada cawan petri yang sudah diisi dengan 25 ml akuades dan 50 µl limbah minyak pelumas. Diamati perubahan yang terjadi pada permukaan minyak dalam cawan petri. Jikat timbul clear zone atau zona bening, maka isolat tersebut mengandung biosurfaktan. 9
B.3.13. Pengukuran densitas minyak (Siaka et al, 2012) Densitas minyak dapat diikur dengan menggunakan alat berupa piknometer. Sebelum digunakan, piknometer ukuran 25 ml terlebih dahulu dikeringkan hingga konstan dalam oven dengan suhu 60 o C. Setelah itu, piknometer tersebut ditimbang hingga didapatkan berat piknometer kosong. Minyak yang akan diukur densitasnya dimasukkan ke dalam piknometer tersebut hingga penuh tanpa ada gelembung udara. Piknometer yang berisi minyak selanjutnya ditimbang untuk bobot piknometer berisi minyak. Pengukuran tersebut diulang sebanyak 3 kali. Angka yang didapat dari hasil penimbangan dimasukkan ke dalam rumus sebagai berikut: (2-5) M 1 : massa piknometer + minyak (g) M 2 : massa piknometer kosong (g) v : volume piknometer (25 ml) C. Metode Analisis Data persentase penurunan kadar minyak yang diperoleh, dianalisis menggunakan ragam uji (Uji F) pada tingkat percayaan 95% - 99%. Jika perlakuan berpengaruh nyata atau sangat nyata maka pengujian dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Jujur (BNJ), dengan tingkat kepercayaan 95%-99%. Data bobot kering miselium akhir, biosurfaktan dan nilai TPH yang diperoleh, dianalisis secara deskriptif. 10