Bab III Bahan dan Metode III.1 Bahan Pada penelitian ini, sampel yang digunakan dalam penelitian, adalah cacing tanah spesies L. rubellus yang berasal dari peternakan cacing tanah lokal di Sekeloa, Bandung. Isolasi RNA total, menggunakan nitrogen cair, buffer AE (Natrium asetat 50mM ph 5,3, EDTA 10 mm), β-merkaptoetanol, larutan SDS 10%, fenol equilibrated, kloroform, dan natrium asetat. Isolasi mrna, menggunakan kit Roche Applied Science. mrna Isolation Kit, Cat. No 1741985, yang terdiri dari streptavidin, hibrid mrna-oligo (dt) 20, buffer lisis (buffer Tris, Lic., EDTA, Litium dodesilsulfat, Ditiotreitol), dan akuades. Isolasi DNA kromosom, menggunakan buffer SNET (Tris-Cl 20 mm ph 8, EDTA 5 mm ph 8, NaCl 400 mm, dan SDS 1%), proteinase K, fenol equilibrated, kloroform, isoamilalkohol, isopropanol, dan akuabides. Proses PCR dan RT-PCR menggunakan campuran enzim (polimerase Taq dan Tgo, dan AMV reverse transcriptase), Taq polimerase, inhibitor RNAse, DTT, dntp, MgCl 2, oligo (dt) 20, primer ZN1 dan ZN2, primer FL1 dan FL2 (Wulan, 2006), buffer PCR, buffer RT-PCR, dan akuabides. III. 2 Alat Alat yang digunakan selama penelitian, meliputi: labu erlenmeyer, gelas kimia, gelas ukur, pipet tetes, labu takar, batang pengaduk, thermometer, tabung nitrogen cair, mikropipet dan tip mikro berukuran 10µl, 100 µl, 1000 µl, batang pengaduk, ph meter model 710 (Thermo Orion), pengaduk magnet (Fischer), mortal dan alu, inkubator goyang (Lab line dan Thermolyne ROSI 1000), timbangan digital model 682B (Mettler Toledo, Switzerland), sentrifuga model JA2-21 (Biofuge) 20
dengan kecepatan 0 12.500 rpm, autoclave (All American, Wiconsin), mesin PCR (BioRad Gene Cycler), lampu UV (Cole Parmer Instrument, France), vortex (Vortex-2 Genie), freezer model 8831 (Caravell, Denmark) suhu 20 o C dan model 3671 (Forma Scientific Inc., USA, Caravell, Denmark) suhu 20 o C, serta elektroforesis (Biorad). Perangkat lunak menggunakan program ClustalX, GeneDoc, dan DNA star (Primer Select, Edit Seq, Seqman). II.3 Metode Penelitian Penelitian pendahuluan merupakan penelitian awal sebelum dilakukan penelitian utama, yang meliputi pengenalan alat dan sistem kerja alat, persiapan alat dan bahan untuk penelitian utama, serta simulasi kerja penelitian utama. Pada penelitian utama, dilakukan perancangan primer, persiapan sampel cacing tanah L. rubellus, isolasi RNA total, isolasi mrna, isolasi DNA kromosom, dan penentuan urutan gen pengode lumbrokinase. II.3.1 Perancangan primer Perancangan primer dilakukan untuk memperoleh gen pengode lumbrokinase pada cacing tanah L. rubellus. Pada umumnya, telah banyak gen pengode lumbrokinase pada cacing tanah yang telah dipublikasikan, namun memiliki urutan cdna pengkode lumbrokinase yang sedikit berbeda. Perancangan primer dilakukan dengan cara mencari daerah lestari cacing tanah L. rubellus yang terdapat pada Gene Bank menggunakan program ClustalX, ditampilkan menggunakan program GeneDoc, dan diolah lebih lanjut menggunakan program DNA Star. III.3.2 Persiapan sampel cacing tanah L. Rubellus Cacing tanah L. rubellus dicuci bersih menggunakan air dari tanah dan kotoran, kemudian dipotong bagian anterior dan posterior. Sedangkan bagian tengah cacing segera dimasukkan ke dalam nitrogen cair dan digerus sampai menjadi serbuk cacing. 21
III.3.3 Isolasi RNA total Isolasi RNA total menggunakan metode isolasi RNA ragi S. cerevisiae (Schmitt et al., 1990). Proses isolasi RNA total dilakukan dengan cara melisiskan 50 mg sel cacing menggunakan 400 µl buffer AE (Natrium asetat 50mM ph 5,3, EDTA 10 mm). Serbuk cacing tersebuk tersebut dimasukkan ke dalam tabung dan divorteks selama 2 30 detik dalam suhu ruang. Kemudian inkubasi selama 4 menit pada 65 o C, lalu dibekukan menggunakan nitrogen cair, proses pemanasan dan pembekuan dilakukan sebanyak 3 kali secara bergantian, setelah itu disentrifugasi selama 4 5 menit. Hasil sentrifugasi tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet ke dalam tabung mikro steril yang baru. Kemudian supernatan yang dihasilkan ditambahkan fenol yang telah dikalibrasi dengan Tris-Cl ph 8,0 dan kloroform dengan perbandingan 5:1, dan inkubasi kembali selama 5 menit, selanjutnya sentrifugasi kembali, sehingga diperoleh supernatan yang merupakan RNA total. Supernatan tersebut diberi etanol 100 persen (etanol p.a) kemudian sentrifugasi kembali. Jika tidak ada pelet maka ditambahkan kembali etanol 100 persen dan sentrifugasi. Pada tahap akhir, pelet yang diperoleh dibilas menggunakan etanol 70 persen, kemudian sentrifugasi. Pemisahan pelet dengan etanol dilakukan menggunakan pipet. Pelet yang telah dicuci dikeringkan dalam oven atau dalam temperatur ruang. Pelet dilarutkan dalam akuabides steril dan larutan RNA total disimpan pada 80 o C. III.3.4 Isolasi mrna Isolasi mrna menggunakan kit (Roche Applied Science. mrna Isolation Kit, Cat. No 1741985). Proses isolasi mrna meliputi persiapan streptavidin, hibridisasi mrna-oligo(dt) 20 berlabel biotin, imobilisasi mrna-oligo(dt) 20 berlabel biotin dengan streptavidin, dan pelepasan mrna dari hibridnya. Persiapan streptavidin dilakukan dengan cara penyimpanan sebanyak 150 µl streptavidin ke dalam tabung mikro, kemudian disimpan dalam pemisah magnet selama 3 menit sehingga seluruh streptavidin menempel pada dinding tabung. 22
Kemudian streptavidin dibilas menggunakan bufer lisis. Setelah itu, streptavidin siap digunakan untuk imobilisasi hibrid mrna-oligo(dt) 20 berlabel biotin. Proses hibridisasi dilakukan dengan cara melarutkan RNA total dalam buffer lisis mencapai volume 200 µl, kemudian ditambahkan sebanyak 1,5 µl oligo(dt) 20 berlabel biotin, dan disuspensi ulang agar larutan homogen. Proses imobilisasi mrna-oligo(dt) 20 berlabel biotin dilakukan dengan cara larutan berisi hibrid mrna-oligo(dt) 20 berlabel biotin dimasukkan ke dalam tabung mikro berisi streptavidin. Tabung tersebut dipisahkan dari pemisah magnet, suspensi ulang, dan inkubasi selama 5 menit pada 37 o C. Setelah terbentuk hibridisasi, tabung mikro tersebut disimpan dalam pemisah magnet selama 3 menit, sehingga streptavidin telah terhibridisasi menempel pada dinding tabung. Dalam hal ini, kemungkinan terjadi penempelan molekul lain, sehingga perlu dilakukan pembilasan menggunakan buffer pencuci sebanyak 2 kali menggunakan 250 µl buffer pencuci pada setiap bilasannya. Tahapan terakhir, yaitu pemisahan mrna dari hibridnya dengan cara elusi mrna dengan akuabides. Tabung berisi hibrid yang telah dibilas menggunakan buffer diangkat dari pemisah magnet, suspensi ulang dengan akuabides, dan inkubasi selama 2 menit pada 65 o C. Setelah mrna terlepas dari hibridnya, dilakukan pemisahan partikel magnetik dari larutan dengan cara meletakkan kembali tabung mikro pada pemisah magnet sehingga oligo(dt) 20 berlabel biotin dengan streptavidin menempel pada dinding. Kemudian larutan mrna dipindahkan ke dalam tabung mikro steril yang baru pada suhu 80 o C. III.3.5 Isolasi DNA kromosom Proses isolasi DNA kromosom (Sambrook and Russel, 2001) dilakukan dengan cara melarutkan 50 mg serbuk cacing dengan buffer SNET (Tris-Cl 20 mm ph 8, EDTA 5 mm ph 8, NaCl 400 mm, dan SDS 1%) dalam tabung mikro kemudian 23
ditambahkan pula 200 µl proteinase K, dan inkubasi menggunakan inkubator goyang pada 55 O C kecepatan 175xg selama 60 menit. Setelah itu, sentrifugasi pada kecepatan 17.500 g pada 4 o C selama 2 menit untuk mengendapkan debris. Supernatan yang diperoleh, dicampur dengan fenol yang telah dikalibrasi dengan Tris-Cl ph 8,0, kloroform, isoamilalkohol dengan perbandingan 25:24:1. Selanjutnya inkubasi goyang pada 37 o C kecepatan 50 g selama 15 menit. Setelah itu, sentrifugasi kembali pada kecepatan 4000 g pada 4 o C selama 5 menit. Produk sentrifugasi tersebut dipisahkan ke dalam tabung mikro steril baru dan tambahkan isopropanol sampai terbentuk DNA (dalam hal ini ditunjukkan dengan terdapatnya benang tipis pada larutan). Pengendapan DNA dilakukan dengan cara sentrifugasi pada 4 o C selama 5 menit. Pelet yang dihasikan dicuci menggunakan etanol 70 persen, sentrifugasi kembali, kemudian dipisahkan, dan dikeringkan pada temperatur ruang atau menggunakan oven selama 20 menit pada 37 o C. Pelet yang telah kering tersebut dilarutkan dalam akuabides steril sebanyak 30 µl. Larutan berisi DNA kromosom disimpan pada 20 o C. III.3.6 Proses PCR Penggunaan mesin PCR dilakukan dalam proses RT-PCR untuk memperoleh fragmen cdna dan proses PCR untuk memperoleh fragmen DNA gen pengode lumbrokinase. Dalam tahap awal optimasi dilakukan proses RT-PCR dan PCR menggunakan variasi suhu annealing. Pada tahapan RT-PCR, menggunakan kit (Roche Applied Science. Titan One Tube RT-PCR Kit. Cat. No 119399323001). III.3.7 Penentuan urutan DNA. Proses pengurutan DNA dilakukan dengan mengirimkan sampel ke Korea (Macrogen Inc., World Meridien Venture 10F 60-24 Kasan Dong Kum chun-ku, Seoul, Korea 153-023). 24