BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Latar dan Waktu Penelitian Tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian daun dari tanaman binahong (A. cordifolia) yang diperoleh dari Desa Toima Kecamatan Kabupaten Luwuk dan sekitarnya.penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia, Jurusan Pendidikan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Gorontalo (UNG) selama ± 6 bulan, mulai dari bulan Agustus 2013-Januari 2014. 3.2 Pendekatan dan Jenis Penelitian Pendekatan dan jenis penelitian yang digunakan adalah jenis penelitian eksperimental yang dilakukan di Laboratorium melalui metode penelitian kualitatif dan kuantitatif. Metode kualitatif digunakan untuk menguji ada tidaknya senyawa aktif flavonoid, alkaloid, steroid, terpenoid dan saponin pada ekstrak daun binahong.metode kuantitatif digunakan untukuji toksisitas ekstrak daun binahong terhadap larva udang Artemia salina Leach dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). 3.3 Alat dan Bahan yang Digunakan 3.3.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat untuk ekstraksi maserasi dan uji fitokimia: Timbangan analitik, blender, seperangkat alat gelas, pipet mikro, pengaduk kaca, aluminium foil, statif, klem, lampu dan aerator. 25
3.3.2 Bahan Tanaman Tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian daun dari tanaman binahong yang diperoleh dari Desa Toima Kecamatan Bunta Kabupaten Luwuk dan sekitarnya.daun binahong dibersihkan, dicuci lalu dikeringkan dengan cara diangin-anginkan dan terhindar dari cahaya matahari secara langsung. 3.3.3 Bahan Kimia Bahan kimia yang digunakan terdiri dari akuades, metanol, n-heksan, etil asetat, pereaksi Hager, Dragendrof, Mayer, Wagner, asam asetat glacial, HCl pekat, serbuk Mg, NaOH, H 2 SO 4 pekat, kloroform, dietil eter, kloroform amonikal. 3.4 Tahap-tahap Penelitian 3.4.1 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Baku Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Binahong. Daun binahong sebanyak 6,4 kg dicuci bersih dan ditiriskan, kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan dan tidak terkena sinar matahari secara langsung dengan suhu di ruangan 35-37 C, kemudian dihaluskan menggunakan blender sampai terbentuk serbukdan dihitung rendemen dengan menggunakan rumus sebagai berikut : Rendemen = Bobot Contoh (g) Bobot Total (g) x 100 % 26
3.4.2 Ekstraksi dan Fraksinasi Sebanyak 250 gram serbuk daun binahong dimaserasi dengan menggunakan pelarut metanol selama 4 x 24 jam, di mana setiap 24 jam ekstrak disaring dan residunya dimaserasi kembali dengan menggunakan metanol yang baru. Proses maserasi dibantu dengan pengadukan sesekali agar proses ekstraksi berlangsung dengan maksimal. Filtrat metanol hasil maserasi seluruhnya digabungkan kemudian dievaporasi dengan menggunakan alat penguap vakum pada suhu 30-40 o C sehingga diperoleh ekstrak kental metanol. Tahap selanjutnya, Ekstrak kental metanol disuspensi dengan campuran metanol-air (1:2).Selanjutnya dipartisi dengan pelarut n-heksan 4 x 200 ml sehingga diperoleh fraksi n-heksan dan fraksi air. Fraksi n-heksan dievaporasi pada suhu 30-40 o C dan menghasilkan ekstrak kental n-heksan. Fraksi air dipartisi kembali dengan pelarut etil asetat 4 x 200 ml sehingga diperoleh fraksi etil asetat dan fraksi air.hasil partisi dievaporasi pada suhu 30-40 o C sehingga diperoleh ekstrak kental etil asetat dan air.kemudian dihitung rendemen saat hasil ekstraksi dan rendemen masingmasing fraksi dilanjutkan dengan uji fitokimia dan uji toksisitas. 3.4.3 Uji Fitokimia Hasil maserasi dan partisi dari tiap-tiap ekstrak diuji fitokimia untuk melihat kandungan senyawa aktif yang terdapat di dalamnya yang meliputi uji flavonoid, uji alkaloid, uji steroid, terpenoid dan saponin. 25
3.4.3.1 Uji Flavonoid Ekstrak kental dari berbagai ekstrak diambil sebanyak 0,1 g dilarutkan dalam 10 ml metanol kemudian dibagi ke dalam 4 tabung reaksi. Tabung pertama digunakan sebagai tabung kontrol, tabung ke dua, ke tiga dan ke empat berturut-turut ditambahkan NaOH, H 2 SO 4 pekat dan serbuk Mg-HCl pekat.warna pada masingmasing tabung dibandingkan dengan tabung kontrol, jika terjadi perubahan warna dari tabung kontrol maka positif mengandung flavonoid.terbentuknya warna merah, kuning atau jingga menunjukan adanya flavonoid. 3.4.3.2 Uji Alkaloid Ekstrak kental dari berbagai ekstrak sebanyak 0,1 g dilarutkan dengan 10 ml kloroform amoniakal dan hasilnya di bagi ke dalam dua tabung reaksi. Tabung pertama diuji dengan pereaksi Hager, tabung kedua ditambahkan dengan 5 ml asam sulfat (H 2 SO 4 ) 2 N. Bagian asam dipisahkan ke dalam 3 buah tabung reaksi kemudian masing-masing diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan cokelat dengan pereaksi Wagner dan endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendrof. 3.4.3.3Uji Saponin Uji saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Ekstrak dari berbagai pelarut sebanyak 0,1 g dilarutkan dengan alkohol kemudian perlahan-lahan ditetesi dengan dengan akuades panas sebanyak 10 tetes. Tabung reaksi dikocok 26
sehingga terbentuk busa.busa yang stabil selama 15 menit dan tidak hilang saat penambahan HCl menunjukan adanya saponin. 3.4.3.4 Uji Terpenoid dan Steroid Ekstrak binahong sebanyak 2 ml ditambahkan asam asetat anhidrat kemudianditambahkan 2 ml asamsulfat pekat. Adanya steroid ditandai dengan perubahan warna dari violet menjadi biru atau hijau.uji terpenoid dilakukan dengan mencampur 5 ml ekstrak dengan 2 ml kloroform.kemudian tambahkan dengan hatihati 3 ml asam sulfat pekat.terbentuknya warna coklat kemerahan pada permukaan dalam larutan, menunjukkan adanya terpenoid. 3.4.4 Identifikasi Gugus Fungsi Senyawa dalam Ekstrak Daun Binahong Gugus fungsi senyawa dalam ekstrak daun binahong diidentifikasi dengan menggunakan spektrofotometer inframerah. 3.4.5 Uji Toksisitas Terhadap Artemia salina Leach (Metode BSLT) Telur Artemia salina Leach sebanyak 2 gram dimasukkan dalam 400 ml air laut yang telah diaerasi dandiberi penerangan dengan cahaya lampu. Telurakan menetas dalam waktu 24-48 jam dan disiapkan untuk digunakan sebagai target uji toksisitas. Perlakuan uji toksisitas dilakukan sebanyak 2 kali pengulangan pada masingmasingekstrak sampel. Botol vial (wadah uji) disiapkan untuk pengujian. Ekstrak metanol, n-heksan dan etil asetat, ditimbang dan dilarutkan dalam air laut untuk membuat larutan stok dengan konsentrasi 2.000 ppm. Dari larutan stok tersebut kemudian dilakukan pengenceran larutan sesuaidengan konsentrasi yang diinginkan, 27
yaitu 1000, 500, 200, 100, dan 50 ppm.10 ekor larva udang dimasukkan dalam vial yang berisi 5 ml larutan uji.kontrol dibuat dengan memasukkan 10 ekor larva udang dalam 5 ml air laut tanpa penambahan larutan uji. Pengamatan dilakukan selama 24 jam dengan selang waktu 8 jam terhadap jumlah kematian larva udang. Analisis data dilakukan untuk mencari LC 50 dengan menggunakan analisis probit, dimana hubungan nilai logaritma konsentrasi bahan toksik uji dan nilai probit dari persentase mortalitas hewan uji merupakan fungsi linear y = a + bx. Nilai LC 50 diperoleh dari anti log m, dimana m merupakan logaritma konsentrasi bahan toksik pada y = 5, yaitu nilai Probit 50% hewan uji, sehingga persamaan regresi menjadi : m = 5 Dengan nilai a dan b diperoleh berdasarkan persamaan sebagai berikut : = 1/ ( ) b = ( ( ) ( X ) ( X) Keerangan : Y : Nilai Probit Mortalitas X : Logaritma konsentrasi bahan uji n : Banyaknya perlakuan a : Konstanta b : Slope/ kemiringan m : Nilai x pada y = 5 LC 50 : Anti log m (Rand dan Petrocelli, 1985 dalam Hendri dkk, 2010). 28
1.5 Teknik Analisis Data Analisis data yang dilakukan untuk mencari LC 50 adalah analisis probit dengan menggunakan program MC excel, dimana hubungan nilai logaritma konsentrasi bahan toksik uji dan nilai probit dari persentase mortalitas hewan uji merupakan fungsi linear y = a + bx. 29