2 PENDAHULUAN Kayu manis (Cinnamomum burmanii) merupakan tanaman tahunan yang memerlukan waktu lama untuk diambil hasilnya. Hasil utama kayu manis adalah kulit batang, dahan, ranting, dan daun. Selain digunakan sebagai rempah atau pemberi cita rasa (flavor), hasil olahan lainnya seperti minyak atsiri dan oleoresin banyak dimanfaatkan dalam industri farmasi, kosmetik, makanan, minuman, rokok, dan sebagainya. Kulit kayu manis merupakan salah satu produk ekspor Indonesia khususnya daerah Sumatera Barat dan Jambi. Harga kulit kayu manis ini relatif murah sehingga diperlukan adanya hasil alternatif lain yang lebih menguntungkan, contohnya ekstrak minyak atsiri. Minyak atsiri terdapat pada bagian kulit dari batang, cabang, serta ranting yang merupakan nilai utama dari kayu manis. Di dalam minyak atsiri terdapat senyawa yang berperan sebagai antioksidan seperti sinamaldehida dan eugenol. Minyak atsiri diperoleh dengan cara penyulingan kulit dan daun kayu manis. Mutu minyak atsiri kayu manis ditentukan oleh tinggi rendahnya kadar sinamaldehida, semakin tinggi kadar sinamaldehida semakin tinggi pula harganya. Menurut Ravindran et al. (2004), minyak atsiri kulit kayu manis mengandung sinamaldehida (51 76%), eugenol, eugenol asetat, sinamil asetat, sinamil alkohol, metil eugenol, benzaldehida, benzil benzoat, linalool, monoterpena, hidrokarbon, kariofilena, safrol, dan lainnya. Senyawa yang bersifat antioksidan digunakan untuk mengurangi ketengikan lemak dan minyak dalam bahan makanan. Antioksidan sintetis, seperti butil hidroksi toluena (BHT), butil hidroksi anisol (BHA), dan butil hidroksi kuinon (TBHQ) sering digunakan secara efektif tetapi membutuhkan perhatian terhadap efek sampingnya. Untuk itulah, muncul keinginan untuk mendapatkan senyawa yang bersifat antioksidatif yang berasal dari bahan alam sebagai alternatif untuk mencegah kerusakan makanan. Antioksidan dari bahan alam dapat memberikan keuntungan lebih dari antioksidan sintetis. Rababah et al. (2004) menyatakan bahwa antioksidan alam umumnya berasal dari rempah-rempah, tanaman herbal, buah buahan, sayur-sayuran, dan biji-bijian. Dari penelitian sebelumnya didapatkan aktivitas antioksidan dari ekstrak kasar etanol dengan IC 50 sebesar 9 μg/ml yang mengandung sinamaldehida sebanyak 68% sebagai komponen utamanya (Ekaprasada 2010). Berdasarkan penelitian tersebut dilakukan isolasi senyawa sinamaldehida dari minyak kayu manis C. burmanii melalui metode kromatografi lapis tipis preparatif yang selanjutnya diuji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil (DPPH) untuk membuktikan bahwa sinamaldehida memiliki aktivitas sebagai antioksidan alami. Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan kontrol positif butil hidroksi toluena (BHT). Penelitian ini didasarkan pada kandungan utama minyak kulit kayu manis yang diduga memiliki aktivitas sebagai antioksidan. BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan Peralatan analitis yang digunakan adalah clevenger Dean Stark, refraktometer Abbe Atago NAR-3T, spektrofotometer UV-tampak PharmaSpec 1700, kromatografi gas spektrometri massa (GCMS) HP Agilent 7890A-5975C inert, piknometer, kromatografi lapis tipis (KLT) silika gel 60 F 254, dan silika gel 60 GF 254 untuk KLT preparatif. Bahan-bahan yang digunakan adalah serbuk kulit kayu manis kering dari daerah Kerinci, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), dan butil hidroksi toluena (BHT). Metode Penentuan Kadar Air (AOAC 2006) Kadar air ditentukan dengan metode gravimetri. Pinggan porselen dikeringkan pada suhu 105 o C selama 30 menit, kemudian didinginkan dalam eksikator dan ditimbang bobot keringnya. Serbuk kayu manis ditimbang sebanyak 1 gram dimasukkan ke dalam pinggan porselen, kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 105 o C selama 3 jam. Setelah itu, pinggan porselen yang berisi serbuk kayu manis didinginkan dalam eksikator dan ditimbang hingga diperoleh bobot konstan (pekerjaan dilakukan triplo).
3 Isolasi Minyak Kulit Kayu Manis Kulit kayu manis kering terlebih dahulu dihaluskan menjadi serbuk berukuran 100 mesh. Serbuk kayu manis yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 200 g, kemudian dilakukan distilasi air dengan metode clevenger menggunakan alat Dean Stark selama 6 jam. Penyulingan dilakukan sebanyak 10 kali. Minyak yang diperoleh dikumpulkan, dikeringkan dengan Na 2 SO 4 anhidrat, dan ditentukan rendemen minyak kasarnya (b/b). Komponen senyawa minyak kasar diidentifikasi menggunakan GCMS berdasarkan library Willey W8N08 tahun 2008. Selain itu, ditentukan bobot jenis serta indeks bias minyak kayu manis yang diperoleh dengan menggunakan piknometer dan refraktometer Abbe. Isolasi Sinamaldehida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Minyak kasar hasil penyulingan ditotolkan pada pelat kromatografi lapis tipis preparatif dengan jarak 1 cm dari tepi bawah pelat fase diam aluminium silika gel F 254 dan eluen (fase gerak) campuran n-heksana:etanol (95:5). Penotolan dilakukan 3 kali ulangan selanjutnya pelat dielusi dengan eluen yang telah dijenuhkan. Elusi dihentikan saat eluen berjarak 1 cm dari tepi atas pelat. Penampakan noda dideteksi di bawah lampu UV 254 nm. Fraksi yang memiliki R f yang sama dengan R f standar sinamaldehida dikerok dan dikumpulkan. Selanjutnya hasil kerokan dilarutkan dengan pelarut metanol dan disaring. Filtrat hasil saringan digunakan untuk uji kualitatif dan analisis GCMS untuk mengevaluasi komponen senyawa yang terkandung di dalamnya. Secara lengkap diagram alir penelitian terdapat pada Lampiran 1. Pengujian Kualitatif Senyawa Sinamaldehida Pengujian kualitatif senyawa sinamaldehida dilakukan menggunakan pereaksi Tollens (tes reduksi perak). Pereaksi Tollens berisi 1 ml perak nitrat 10% dan 1 ml NaOH 10% ditambah NH 4 OH 6 M sampai semua perak hilang. Filtrat hasil isolasi sinamaldehida sebanyak 1 3 tetes diteteskan ke dalam pereaksi Tollens lalu dikocok selama 1 menit. Tes positif ditunjukkan dengan terbentuknya cermin perak dalam tabung reaksi setelah dipanaskan selama 5 menit. Senyawa sinamaldehida juga diuji dengan adisi bisulfit. Adisi bisulfit menggunakan NaHSO 3 39%. Larutan bisulfit sebanyak 5 ml ditambahkan 1 3 tetes filtrat hasil isolasi lalu dikocok selama 1 menit. Tes positif ditunjukkan dengan adanya endapan kristal putih. Pengujian Aktivitas Antioksidan (Lin et al. 2007) Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH. Senyawa hasil isolasi ditimbang sebanyak 5 mg kemudian dilarutkan dalam 50 ml metanol (100 ppm larutan induk). Larutan uji aktivitas antioksidan dibuat menjadi 5, 10, 25, 50, dan 100 ppm dari larutan induk. Setiap larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml kemudian ditambahkan 1 ml larutan DPPH 0.1 mm dalam metanol. Larutan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 o C. Nilai serapan DPPH diukur dengan spektrofotometer UV-tampak pada panjang gelombang 515.5 nm sebagai persen inhibisi setelah 30 menit (% inhibisi). Aktivitas antioksidan diperoleh dari penurunan serapan larutan DPPH akibat adanya tambahan sampel. % Inhibisi = A blangko A sampel A blangko 100% Keterangan : A blangko = Absorbans tidak mengandung sampel A sampel = Absorbans sampel Nilai hasil perhitungan dimasukkan ke dalam persamaan garis y = ax + b dengan ln konsentrasi (ppm) sebagai absis (sumbu x) dan nilai % inhibisi sebagai ordinatnya (sumbu y). Nilai IC 50 dari perhitungan pada saat % inhibisi sebesar 50% akan diperoleh dari persamaan garis. BHT digunakan sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 5, 10, 25, 50, dan 100 ppm untuk mengetahui perbandingan aktivitas antioksidan yang diperoleh pada senyawa sinamaldehida dengan kontrol positif. HASIL Isolat Minyak Kulit Kayu Manis Kulit kayu manis pada Gambar 1a dihaluskan menjadi serbuk berukuran 100 mesh. Kadar air rerata yang diperoleh dari serbuk kulit kayu manis sebesar 10.65%. Isolasi minyak sinamon dilakukan dengan
4 metode clevenger. Distilasi menghasilkan dua lapisan, yaitu lapisan air dan minyak. Tabel 1 menunjukkan hasil distilasi serbuk kulit kayu manis menghasilkan isolat berupa minyak sinamon yang berwarna kuning jernih, beraroma halus, serta berasa manis dan pedas sebanyak 18.68 g atau 19 ml (Gambar 1b). Produk ini telah dikeringkan dengan Na 2 SO 4 anhidrat. Rendemen minyak diperoleh sebesar 0.93% (b/b) atau 0.95% (v/b). (a) (b) Gambar 1 Kulit kayu manis (a) dan minyak sinamon hasil isolasi (b). Hasil analisis komponen senyawa dengan GCMS terhadap minyak sinamon memberikan kromatogram dengan 47 komponen senyawa (Gambar 2). Tiga komponen senyawa utama yang terkandung di dalam minyak sinamon kasar kulit kayu manis tersebut adalah senyawa trans-sinamaldehida sebanyak 32.8% pada waktu retensi (RT) 8.396, senyawa 3- fenil-2-propenal sebanyak 22.9% (RT 8.298), dan sikloheksana sebanyak 4.3% (RT 7.074). Komponen senyawa minor lainnya terdapat pada Lampiran 2. Bobot jenis minyak sinamon kulit kayu manis yang diperoleh dari tiga kali ulangan berkisar 1.0247 1.0269. Indeks bias pada suhu 20 o C minyak sinamon adalah 1.5605 1.5826. Tabel 1 Hasil distilasi air serbuk kulit kayu manis No Bobot serbuk (g) Bobot minyak (g) 1 200.08 1.88 2 200.06 1.85 3 200.05 1.85 4 200.01 1.84 5 200.07 1.88 6 200.10 1.89 7 200.01 1.85 8 200.05 1.89 9 200.03 1.88 10 200.04 1.87 Total 2000.50 18.68 Gambar 2 Kromatogram GCMS minyak sinamon kulit kayu manis.
5 Isolat Sinamaldehida Sampel minyak sinamon hasil distilasi dipisahkan melalui KLT dengan menggunakan pelat aluminium silika gel 60 F 254 dan eluen n-heksana:etanol (95:5). Kromatogram KLT minyak sinamon terlihat pada Gambar 3. Di bawah lampu UV terdapat lima noda yang terpisah dengan nilai R f pada Tabel 2. Uji Kualitatif Fraksi ke-3 hasil isolasi sinamaldehida KLT preparatif diuji secara kualitatif dengan menguji kehadiran aldehida menggunakan pereaksi Tollens dan adisi bisulfit. Gambar 4 menunjukkan terbentuknya cermin perak dan endapan putih dari hasil uji kualitatif terhadap fraksi yang ke-3. Gambar 3 Kromatogram KLT minyak sinamon kulit kayu manis. Tabel 2 Nilai Rf hasil KLT Gambar 4 (a) (b) (a) Uji kualitatif kehadiran aldehida dan (b) uji senyawa karbonil. Uji Kuantitatif Analisis komponen senyawa penyusun fraksi yang ke-3 menunjukkan 10 komponen senyawa, termasuk di dalamnya adalah puncak senyawa pelarut dan eluen yang digunakan selama proses isolasi (Gambar 5). Tiga komponen senyawa terbesar yang terkandung di dalam fraksi ke-3 menunjukkan senyawa trans-sinamaldehida sebanyak 48.8%, senyawa 3-fenil-2-propenal 40.3%, dan metanol 9.4%. Daftar selengkapnya terdapat pada Lampiran 3. Gambar 5 Kromatogram GCMS fraksi ke-3 minyak kulit kayu manis.
6 Uji Aktivitas Antioksidan Uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH menunjukkan adanya aktivitas antioksidan pada fraksi sinamaldehida yang diperoleh dari hasil isolasi KLT preparatif. Aktivitas antioksidan fraksi sinamaldehida menghasilkan nilai IC 50 sebesar 5.06 mg/l. (Tabel 3). Tabel 3 Data IC 50 sinamaldehida dari hasil isolasi dan senyawa kontrol positif Sampel Sinamaldehida 5.06 BHT 10.4 Vitamin E* 61.1 *Lin et al. (2007) IC 50 (mg/l) Sinamaldehida dari hasil isolasi memiliki aktivitas antioksidan yang lebih besar dibandingkan dengan senyawa antioksidan lainnya seperti BHT dan vitamin E (Lin et al. 2007). Hal ini ditunjukkan pada Gambar 6. Gambar 6 Perbandingan aktivitas antioksidan sinamaldehida dan senyawa kontrol positif. PEMBAHASAN Isolat Minyak Kulit Kayu Manis Sampel kulit kayu manis yang digunakan dalam penelitian ini adalah serbuk yang berukuran 100 mesh. Penentuan kadar air dilakukan sebelum proses isolasi minyak kulit kayu manis yang berfungsi menyatakan kandungan zat dalam tumbuhan sebagai persen kering, mengetahui cara penyimpanan sampel yang baik, dan menghindari pengaruh mikrob. Menurut Winarno (1997), sampel yang baik disimpan dalam jangka panjang adalah yang memiliki kadar air kurang dari 10%. Kadar air serbuk kulit kayu manis adalah 10.65%. Hal ini memperlihatkan bahwa kadar air yang terkandung di dalam sampel lebih besar dari 10% sehingga membutuhkan perhatian dalam penyimpanan sampel agar tidak cepat rusak. Faktor yang perlu diperhatikan dalam proses penyimpanan antara lain kelembapan udara, perlakuan terhadap bahan, waktu penyimpanan, besarnya penguapan, dan kemungkinan teroksidasinya sampel. Berdasarkan standar mutu SNI 01-3714- 1995 (Lampiran 4), kadar air maksimum yang diperbolehkan terkandung di dalam serbuk kulit kayu manis adalah 12%. Hal ini menunjukkan bahwa kadar air sampel kayu manis yang digunakan di dalam penelitian ini telah memenuhi standar mutu. Serbuk kulit kayu manis sebanyak 2000.50 g didistilasi selama 6 jam. Rendemen minyak yang diperoleh sebesar 0.93% (b/b) atau 0.95% (v/b). Rendemen minyak semakin meningkat bergantung pada lamanya distilasi dan tingginya suhu pemanasan (Ginting 2004). Akan tetapi, suhu yang tinggi juga dapat menyebabkan terjadinya degradasi komponen minyak atsiri sehingga kehilangan aroma khas minyak kulit kayu manis (sinamon). Rendemen minyak sinamon yang diperoleh sangat bergantung pada kehalusan simplisia (Kurniawan 1996). Proses distilasi selama 8 jam menghasilkan rendemen minyak kayu manis 1.3% (b/b) dengan menggunakan metode clevenger (Sulaswatty et al. 2001), sedangkan pada penelitian ini distilasi dilakukan selama 6 jam. Kadar minyak atsiri yang harus dimiliki kulit kayu manis maksimum adalah 0.7% bersumber pada SNI 01-3714-1995. Hal ini disebabkan perbedaan metode yang digunakan, yaitu distilasi air dan distilasi uap air. Minyak sinamon dari hasil isolasi menghasilkan nilai indeks bias dan bobot jenis yang masih berada pada selang yang digunakan sebagai syarat mutu minyak kulit kayu manis berdasarkan SNI 06-3734-2006 (Lampiran 4). Hasil analisis GCMS terhadap minyak sinamon menghasilkan kadar sinamaldehida sebesar 55.7% yang terdiri atas senyawa trans-sinamaldehida dan 3-fenil-2-propenal. Hal ini berarti bahwa sinamaldehida merupakan komponen utama penyusun minyak sinamon kulit kayu manis C. burmanii. Syarat minimum kadar