16 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN Bab ini menggambarkan tahapan penelitian yang terdiri dari pengambilan sampel, penyiapan templat mtdna dengan metode lisis sel, amplifikasi D-loop mtdna dengan teknik PCR, sekuensing nukleotida dengan metode dideoksi Sanger, serta analisis mutasi menggunakan program Seqman DNASTAR. Tahapan penelitian tersebut ditunjukkan dalam bentuk diagram alur penelitian (Gambar III.1) : Pengambilan sampel Individu umur 10,20,30,40,80 Darah, Epitel, dan Rambut Penyiapan templat mtdna dengan metode lisis sel Amplifikasi fragmen 1 kb D-loop mtdna dengan teknik PCR Elektroforesis gel agarosa Sekuensing nukleotida dengan metode dideoksi Sanger Analisis urutan nukleotida dan mutasi menggunakan program Seqman DNASTAR Primer M1 dan HV2R standar puc19/hinfi Primer M1 dan M2 Gambar III.1. Diagram alur penelitian. Lima tahapan penelitian meliputi : pengambilan sampel, penyiapan templat mtdna dengan metode lisis, amplifikasi dengan teknik PCR menggunakan primer M1 dan HV2R, sekuensing dengan metode dideoksi Sanger menggunakan primer M1 dan M2, analisis urutan nukleotida dan mutasi menggunakan program Seqman DNASTAR.
17 III. 1. Pengambilan Sampel Karakteristik kelima individu yang dijadikan sampel dalam keadaan sehat dan tidak memiliki hubungan kekerabatan antara satu individu dengan individu yang lain. Sampel terdiri dari tiga sel berbeda (darah, epitel dan rambut) berasal dari lima individu umur berbeda (10, 20, 30,40, dan 80 tahun). Pengambilan sampel rambut dan epitel dilakukan sendiri oleh peneliti terhadap lima individu. Sedangkan pengambilan sampel darah pada lima individu menggunakan jasa perawat kesehatan. Pengambilan sampel rambut menggunakan pinset telah disterilkan dengan alkohol 70%, kemudian dimasukkan kedalam plastik steril dan disimpan dalam temperatur -20 o C. Pengambilan sampel epitel rongga mulut menggunakan kertas saring berukuran 4 x 8 cm yang telah disterilkan dengan alkohol 70%. Kertas saring ditempelkan di lidah dan di langit-langit mulut kiri dan kanan sekitar 30 detik. Kertas saring yang mengandung sel epitel dimasukkan dalam plastik steril dan disimpan dalam temperatur -20 o C. Pengambilan sampel darah menggunakan jarum suntik (siringe) berukuran 3 ml, kemudian dimasukkan dalam tabung yang berisikan 1 µg EDTA, selanjutnya disimpan dalam temperatur -20 o C. III. 2. Penyiapan Templat mtdna Templat mtdna disiapkan menggunakan metode lisis sel. Lisis sel dilakukan dalam buffer lisis yang terdiri atas 50 mm Tris-HCl ph 8,5; 1 mm EDTA ph 8,0; dan 0,5% Tween-20 (Noer et al.,1994). III.2.1. Lisis Sel Akar Rambut Lisis sel akar rambut dimulai dengan memotong kecil-kecil 5-7 helai rambut pada bagian akarnya (berwarna keputihan) menggunakan pisau yang telah disterilkan dengan alkohol 70%. Potongan akar rambut ini kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml berisi 30 µl buffer lisis dan 10 µl proteinase K 20 mg/ml ditambahkan ddh 2 O 260 µl. Kemudian diinkubasi selama 1 jam pada 50 0 C dan dilanjutkan selama 10 menit pada penangas air mendidih. Campuran ekstrak sel
18 disentrifugasi menggunakan mikrosentrifuga dengan kecepatan 12000 rpm selama 3 menit. Supernatannya merupakan sumber mtdna templat untuk reaksi PCR. III.2.2. Lisis Sel Epitel Lisis sel epitel dimulai dengan memotong kecil-kecil kertas saring yang mengandung sel epitel dalam tabung mikro 1,5 ml. Proses selanjutnya dilakukan sama seperti pada lisis sel akar rambut. III.2.3. Lisis Sel Darah Lisis sel darah dimulai dengan mengambil 100 µl darah dengan mikro pipet lalu dimasukkan dalam tabung 1,5 ml lalu ditambahkan 500 µl buffer TE, dihomogenkan dengan vortex 30 detik kemudian disentrifugasi 8000 rpm 1 menit, supernatan dibuang, pengerjaannya dilakukan hingga diperoleh pelet putih bersih, siap di lisis. Lisis dilakukan sama seperti pada lisis sel folikel akar rambut, hanya saja campuran ekstrak sel disentrifugasi menggunakan mikrosentrifuga dengan kecepatan 8000 rpm selama 3 menit (DeLong Frost dan Peart, 2003). III. 3. Amplifikasi Fragmen 1 kb D-loop mtdna dengan Teknik PCR Amplifikasi fragmen 1 kb daerah D-loop mtdna untuk semua sampel dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer M1 dan HV2R yang dikembangkan oleh (Rahmadi, 2007) (Tabel III.1) : Tabel III.1. Jenis, posisi dan ukuran primer amplifikasi Primer 5 3 Posisi Ukuran M1 (Forward) CACCATTAGCACCCAAAGCT 15978-15997 20 nukleotida HV2R (Reverse) CTGTTAAAAGTGCATACCGCC H429-409 21 nukleotida Ket : Primer M1 sepanjang 20 nukleotida digunakan sebagai primer forward dan Primer HV2R sepanjang 21 nukleotida digunakan sebagai primer reverse
19 Reaksi PCR dilakukan dalam tabung mikro 0,5 ml yang berisi 50 µl campuran reaksi terdiri dari 1,25 unit enzim Taq DNA polymerase, 5 µl cuplikan hasil lisis, 20 pmol masing-masing primer M1 dan HV2R, 5 µl buffer PCR 10x (Tris-HCl 100 mm ph 9; KCl 500 mm; MgCl 2 15 mm), 0,2 mmol dntp yang terdiri atas datp, dttp, dgtp, dctp, dan ddh 2 O steril. Proses PCR dilakukan dalam mesin Automatic Thermal Cycler sebanyak 30 siklus, dimana setiap siklus terdiri dari tahap denaturasi templat pada 94 0 C selama 1 menit, tahap penempelan primer pada 50 0 C selama 1 menit, dan tahap pemanjangan primer pada 72 0 C selama 5 menit. Tahapan PCR yang dilakukan terdiri dari denaturasi pada 94 0 C selama 1 menit, annealing (penempelan primer) pada suhu 50 0 C selama 1 menit, dan perpanjangan primer oleh DNA polimerase pada suhu 72 0 C selama 1 menit. Reaksi PCR dilakukan sebanyak 30 siklus, dan untuk menyempurnakan reaksi, di akhir siklus ditambahkan satu tahap polimerisasi pada suhu 72 0 C selama 5 menit. Hasil PCR dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v). Gel agarosa dibuat dengan cara mendidihkan 0,4 gram agarosa dalam 40 ml TAE 1x (Tris-asetat 0,04 μ L; EDTA 0,01 μ L ph 8,0) hingga agarosa larut sempurna (larutan homogen). Larutan ini kemudian didinginkan hingga suhu berkisar antara 50-60 0 C dan ditambahkan 2 μ L larutan etidium bromida (EtBr) 10 μ g/ml. Larutan agarosa yang telah mengandung EtBr kemudian dituang ke dalam cetakan gel yang memiliki sisir sebagai pembentuk deretan sumur dalam gel, dan dibiarkan beberapa lama hingga larutan agarosa membeku membentuk gel. Gel agarosa yang telah membeku diletakkan di dalam alat mini sub TM DNA electrophoresis cell dan direndam dalam buffer TAE 1x yang merupakan media penghantar arus listrik. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 80 volt selama 1 jam. Sebelum elektroforesis dijalankan, ke dalam sumur pada gel agarosa dimasukkan 5 μ L cuplikan hasil reaksi PCR yang telah dicampur dengan 2 μ L loading buffer (sukrosa 50%, EDTA 0,1 M ph 8,0; bromfenol biru 0,1% ph 8,0). Untuk analisis ukuran DNA, bersama-sama fragmen mtdna hasil PCR turut
20 dielektroforesis pula standar DNA puc19 yang dipotong dengan enzim HinfI. DNA hasil elektroforesis dapat dilihat secara visual menggunakan lampu ultra violet dan dapat didokumentasikan dengan pemotretan menggunakan kamera (Sambrook et al., 1989). III. 4. Penentuan Urutan Nukleotida (Sekuensing) Penentuan urutan nukleotida dimulai dengan penyiapan reaksi sekuensing. Hasil PCR yang telah diperbanyak hingga 700 ng dimasukkan dalam tabung mikro ukuran 1,5 ml. Primer M1 disiapkan dengan konsentrasi 10 pmol/µl dalam tabung mikro 1,5 ml. Untuk satu kali reaksi sekuensing dibutuhkan 3 µl primer dengan konsentrasi 10 pmol/µl. Urutan nukleotida fragmen 1 kb daerah D-loop mtdna hasil PCR sekitar 1021 pb ditentukan dengan metode dideoksi Sanger oleh Macrogen Inc., South Korea menggunakan primer M1 dan M2 (Tabel III.2). Tabel III.2. Jenis, posisi dan ukuran primer sekuensing Primer sekuensing 5 3 Posisi Ukuran M1 (Forward) CACCATTAGCACCCAAACCT 15978-15997 20 nukleotida M2 (Reverse) TGATTTCACGGAGGATGGTG 16420-16401 20 nukleotida Ket : Primer M1 sepanjang 20 nukleotida digunakan sebagai primer forward dan Primer M2 sepanjang 20 nukleotida digunakan sebagai primer reverse Data yang diperoleh berupa elektroforegram dalam bentuk abi file, dimana masing-masing basa ditunjukkan oleh warna puncak yang berbeda, yaitu basa Adenin ditunjukkan dengan warna hijau, basa Guanin warna hitam, basa Timin warna merah, dan basa Sitosin warna biru. Selain eletroforegram, diperoleh juga urutan nukleotida lengkap dalam bentuk text file yang diperoleh dari Macrogen Inc., Korea.
21 III.5. Analisis Urutan Nukleotida dan Mutasi dengan Program Seqman DNASTAR Program seqman DNASTAR ditujukan untuk menganalisis urutan nukleotida dengan cara membandingkan urutan nukleotida antar sampel, dan analisis mutasi dengan cara membandingkan urutan nukleotida sampel dengan Cambridge Reference Sequence (CRS). Melalui program ini, urutan nukleotida antar sampel dapat ditampilkan secara bersamaan melalui penjajaran sehingga perbedaan urutan nukleotida diantara sampel dapat diamati. Pengamatan ditujukan untuk melihat perbedaan urutan nukleotida sel darah, epitel dan rambut untuk individu yang sama. Analisis mutasi menggunakan program seqman DNASTAR dengan cara membandingkan urutan nukleotida sampel dengan CRS. Cara tersebut memberikan informasi tentang jumlah, jenis, dan posisi mutasi pada tiap sampel. Pengamatan ini ditujukan untuk melihat perbedaan pola mutasi pada sel darah, epitel, dan rambut untuk individu yang sama dan individu lain dengan umur berbeda.