OH OH HO O OH OH S2-Kimia Institut Pertanian Bogor ANTIOKSIDAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN ANTIOKSIDAN Zat yang menghambat/mencegah oksidasi menghambat kerusakan lemak/minyak akibat oksidasi Oksidasi Lemak: Inisiasi; propagasi; terminasi Inisiasi : RH + I R + H + I(inisiator) Propagasi : R + O 2 ROO ROO + RH ROOH + R Terminasi: ROO + ROO ROOR + O 2 R + R RR ROO + R ROOR Menghambat oksidasi zat yang mudah teroksidasi walau dalam konsentrasi rendah 2 1
Penggolongan: Antioksidan primer: menghentikan reaksi berantai pembentukan radikal Antioksidan sekunder/antioksidan preventif: mencegah reaksi oksidasi /mengurangi laju reaksi awal (mencegah kerja faktorfaktor yang mempercepat oksidasi (misalnya Fe, Cu dsb) Mekanisme kerja antioksidan - Melepaskan Hidrogen - Melepaskan elektron - Membentuk kompleks dengan lemak Contoh antioksidan Vitamin E (tokoferol), vvitamin C, karotenoid BHA (Butylated Hydroxy Anisol); BHT 3 Teknik Uji Aktivitas Antioksidan Metode Penangkapan Radikal DPPH DPPH (difinil pikrill hidrazil) : radikal bebas yang stabil berwarna ungu dalam larutan, λ maks 515-525 nm dapat ditangkap oleh reduktor yang memberikan atom H bentuk terreduksi (difinil pikril hidrazin) yang tidak berwarna, dengan reaksi: Difinil pikril hidrazil (ungu) antioksidan Difinil pikril hidrazin (tidak berwarna) 4 2
Cara Uji Bahan uji + DPPH dalam metanol 30menit, 37 o C A 517? = A sampel DPPH dalam metanol 30menit, 37 o C A 517? = A blanko % penangkapan radikal DPPH = (A blangko A sampel )/A blangko x 100% Perbandingan aktivitas : dengan tokoferpl, BHT dsb 5 Metode reduksi Cerium (IV) Senyawa antioksidan bisa berperan sebagai pemindah elektron. perusakan struktur oleh oksidator kuat seperti Ce(IV)sulfat tidak terjadi, karena Ce(IV) menyerang antioksidan Ce(IV) : menyerap uv λ 320 nm Ce(IV) bereaksi dengan antioksidan Ce(III) tidak menyerap pada 320 nm serapan pada 320 nm menurun 6 3
Cara Uji Bahan Uji + Ce(IV)sulfat dalam H 2 SO 4 30 menit suhu ruang A 320 Ce(IV)sulfat dalam H 2 SO 4 sebagai blangko 30 menit suhu ruang A 320 Kapasitas reduksi = (A blangko - A sampel )/A blangko x 100% 7 Metode Tiosianat Prinsip: asam linoleat teroksidasi menghasilkan radikal bebas; radikal bebas mengoksidasi Fe 2+ menjadi Fe 3+ yang bereaksi dengan SCN membentuk Fe(SCN) 3 yang berwarna merah A 500? - 2.51% asam linoleat dalam 99.9% etanol - Sampel dilarutkan dalam air/etanol - Buffer fosfat 0,02M ph 7 - Ferroklorida (FeCl 2 0,02M dalam HCl 3,5%) - Ammonium tiosianant (NH 4 )SCN 30% 8 4
4 mg sampel 4mL etanol 99.5% 4,1mL asam linoleat 2,51% 8 ml buffer fosfat 3,1 ml akuades 40 o C, gelap Campuran A 0,1 ml campuran A 9,7 ml etanol 75% 0,1 ml (NH 4 )SCN 30% 0,1 ml FeCl 2 0,02M dalamhcl 3 menit A 500 Pengukuran dilakukan setiap 24 jam sampai A kontrol maksimum 9 Penentuan Fraksi Aktif Antioksidan dengan cara Bioautografi Sampel diekstraksi ekstrak difraksionasi fraksi aktif? Cara: f S1 S2 S3 f S1 S2 S3 f S1 S2 S3 elusi Semprot DPPH s o o o s o s Sampel 1: Fraksi 2 & 4 aktif Sampel 2: Fraksi 1, 3, 4 aktif Sampel 3: Fraksi 2 aktif 10 5
Uji antioksidan lain CUPRAC ABTS Bleaching karotenoid dll Perhatikan prinsip analisisnya KAJIAN JURNAL Fitoterapia 78 (2007) 401-408 MT Chomnawang, S Surassmo, VS Nukoolkarn, W Gritsanapan EFFECT OF GARCINIA MANGOSTANA ON INFLAMMATION CAUSED BY PROPIONIBACTERIUM ACNES 12 6
DPPH radical scavenging activity drying Sample 1mg/ml CHCl 3 :EtOAc (1:4) 8 hours Spraying with 0.2% DPPH active 13 Reaction oxygen species production assay Preparation of P.acnes culture supernatant Cultivated 72 h BHI & glucose Anaerobic 37 o C Stored at - With extract 20 o C until Without extract 100 g/ml use Nitroblue tetrazolium dye (NBT) reduction test Incubated 37 o C 30 min 25 o C 20 min 100 l NBT in PBS 100 l 25 o C 15 min 50 l 500 l Venous blood Stained by Leishman stain Counting formazan deposit Polymorphonuclear leukocytes (PMNLs) 14 7
Plants Free radical Scavenging of the Thai medicinal plants extracts IC50 values ( g/ml) %superoxide radical inhibition ratio SD G.Mangostana 6.13 77.80 1.28 H.Cordata 32.53 62.67 0.75 E.Odoratum 67.55 44.89 1.38 S. Alata 112.46 35.18 2.66 B. Lupulina >150 10.74 0.86 S. Siamea >150 67.60 1.47 A.paniculata >150 8.02 2.11 15 Influence of G.mangostana extract on ROS level 16 8