III. Bahan dan Metode A. Bahan Sampel yang digunakan adalah bakteri penghasil biopigmen hasil isolasi dari Acropora nasuta yang diambil dari Taka Cemara Karimunjawa, Jepara, Jawa Tengah. Bahan kimia yang digunakan diantaranya yeast extract, peptone, agar bacteriological, untuk isolasi dan kultur bakteri, etanol, n-heksana, aseton, metanol, asetonitril, ammonium asetat, gas N2, akuades, dan akuabides untuk ekstraksi dan identifikasi pigmen dengan UV-Tampak dan KCKT. TE buffer, lysozym, SDS 10%, NaCl 5 M, CTAB, Chloroform, Isopropanol, Etanol 70% digunakan untuk ekstraksi DNA. Akuabides steril, primer 27 o F, primer 1492R, DNA template pengenceran 100x, Mega Mix Royal untuk identifikasi bakteri. B. Metode Sampling Organisme Laut Sampel karang lunak Acropora nasuta diambil dari perairan Taka Cemara Karimunjawa di kedalaman kurang lebih 2 meter dengan peralatan scuba diving. Setelah pengambilan, sampel karang lunak segera dimasukkan ke dalam cool box yang sebelumnya telah diisi dengan es. 11
Sampel dicuci 3 dengan akuades steril untuk menghindari kontaminasi air laut. Pembuatan Media dan Isolasi Bakteri Media yang digunakan adalah ZoBell 2216E marine agar medium. Sebanyak 1 L media Zobell 2216E Agar dibuat dengan mencampurkan 7.5 gram agar bacteriological, 2.5 gram peptone, 0.5 gram yeast extract ditambahkan air laut hingga mencapai volume 1000 ml dan dihomogenisasi dengan pengaduk magnetik. Campuran tersebut selanjutnya disterilisasi dalam autoclave pada suhu 121 C selama 15 menit. Isolasi bakteri dilakukan dengan pemotongan bagian tubuh organisme laut, kemudian diencerkan dan ditanam pada media Zobell 2216E Agar dalam cawan petri. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar (±30 o C) selama 48 jam (Radjasa dkk, 2007). Berdasarkan morfologi warna dari koloni-koloni bakteri yang tumbuh, dilakukan pemurnian dengan teknik goresan (streak method) pada cawan petri (Madigan dkk, 2000). 12
Reaksi berantai polimerase (PCR) 16S rdna 1. Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA dilakukan menurut Ausubel dkk (1995). Kultur bakteri cair sebanyak 3 ml dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml, kemudian disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan (cairan) dibuang sehingga akan didapat sel-sel bakteri dalam bentuk pelet. Pelet bakteri ditambahkan 500 μl TE buffer lalu divortex selama 5 menit, ditambahkan 40 μl Lysozym dan diinkubasi dalam waterbath pada suhu 37 C selama 1 jam. Selanjutnya larutan ditambahkan 200 μl SDS 10% dan diinkubasi kembali, selanjutnya larutan ditambahkan 100 μl NaCl 5 M dan 80 μl CTAB dan diinkubasi pada suhu 68 C selama 10 menit sampai larutan jernih. Larutan ditambahkan kloroform sampai volume tabung 1,5 ml lalu tabung dibolak-balik dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan di bagian atas cincin dipindahkan ke tabung eppendorf baru, ditambahkan Isopropanol (dengan volume 0,6x volume supernatan) kemudian dibolakbalik dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang, lalu ditambahkan 100 μl Etanol 70% dan disentrifugasi kembali pada 13.000 rpm selama 1 menit. Etanol dibuang (usahakan agar pelet tidak ikut terambil) kemudian pelet 13
dikering anginkan. Setelah kering, pelet ditambahkan 15 μl TE Buffer. Ekstrak DNA disimpan dalam lemari pendingin pada suhu -20 o C. 2. Amplifikasi PCR 16S rdna Campuran bahan-bahan yang digunakan yaitu akuabides steril (9,5 µl), primer 27 o F (1 µl), primer 1492 R (1 µl), DNA template pengenceran 100x (1 µl), Mega Mix Royal (12,5 µl) sehingga total volume 25 µl. Primer yang digunakan untuk PCR 16S rdna adalah primer universal 27 o F (5'-AGAGTTTGATCMTG GC TCAG-3') dan primer spesifik eubacteria 1492R (5'-TACG GYTACCTTGTTACGACTT-3') (Isnansetyo dan Kamei, 2003). Bahan-bahan tersebut dicampur dalam tabung PCR 0,2 ml, dengan perlakuan suhu yang digunakan pada PCR adalah: denaturasi pada 94 o C selama 3 menit, kemudian sebanyak 30 siklus (annealing pada 55 o C selama 60 detik, extension pada 72 o C selama 90 detik dan terakhir ~4 o C (Sabdono, 2001). Visualisasi produk PCR 16S rdna ini dilakukan melalui elektroforesis dengan memasukkan 5 μl produk PCR ke dalam sumur gel agarosa 1%. Pembuatan gel agarosa 1% dilakukan dengan melarutkan 1 g agarosa dalam 100 ml larutan TAE buffer 1x, lalu dipanaskan sampai homogen (jernih). Larutan gel dituang dalam 14
cetakan dengan sisir cetakan yang dipasang dengan posisi tegak hingga melewati sisir sesuai dengan ketebalan yang diinginkan. Gel dibiarkan beberapa saat sampai mengeras. Selanjutnya gel direndam dalam larutan buffer TAE 1, kemudian dielektroforesis dengan voltase sebesar 100 V selama ± 30 menit. Setelah elektroforesis, gel direndam dalam etidium bromida selama 10 menit untuk mewarnai pita DNA yang terperangkap pada gel. Terakhir, pita hasil PCR dapat dilihat dengan alat UV transluminator. 3. Purifikasi Produk PCR 16S rdna Purifikasi dilakukan untuk mendapatkan DNA murni hasil amplifikasi PCR 16S rdna. Bahan yang digunakan yaitu High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Germany) yang terdiri dari tiga larutan yaitu, larutan 1 (binding buffer), larutan 2 (washing buffer) dan larutan 3 (elution buffer). Langkah awal dalam proses purifikasi adalah fragmen DNA target pada gel agarosa dipotong secara utuh menggunakan cutter tajam dan steril yang kemudian fragmen DNA tersebut ditampung dalam tabung ependorf 1,5 ml (berat tabung sudah ditera sebelumnya). Tabung ependorf ditimbang kembali untuk mendapatkan berat gel agarosa. Larutan 1 ditambahkan ke dalam tabung (setiap 15
100 mg gel agarosa ditambahkan 300 µl larutan 1) kemudian divortex selama 15-30 detik. Selanjutnya DNA diinkubasi dalam waterbath pada suhu 56 o C selama 10 menit, namun setiap 3 menit sekali divortex. Setelah gel mencair, larutan ditambahkan isopropanol 150 µl pada setiap 100 mg gel agarosa. Selanjutnya larutan dimasukkan dalam tabung filter yang telah dimasukkan dalam tabung receiver sebelumnya dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 30 detik. Penyaringan dilakukan sampai larutan hasil pengenceran gel agarosa habis. Tabung filter mempunyai matriks pengikat DNA yang akan menahan DNA target. Pelet yang tersaring dalam tabung filter diambil, ditambahkan 500 µl larutan 2, lalu disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 1 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan kembali dengan larutan 2 sebanyak 200 µl lalu divortex selama 1 menit. Supernatan dibuang, tabung filter dipindahkan ke dalam tabung ependorf steril yang baru. Sebanyak 50 µl larutan 3 dimasukkan ke dalam tabung filter dan disentrifugasi kembali pada 13.000 rpm selama 1 menit. Hasil purifikasi DNA (larutan yang tertampung dalam tabung) kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1% untuk mengetahui hasil purifikasi. 16
Sekuensing Sekuensing dilakukan menurut siklus PCR sekuensing menggunakan Big Dye Terminator v.3.1. Formula untuk reaksi PCR sekuensing yaitu: 2 μl big dye, 2 μl buffer 10x, 4 μl templet DNA, 1 μl primer dengan konsentrasi 3,2 pmol, ddh2o hingga volume akhir 10 μl. Amplifikasi DNA dilakukan dengan pengkodisian alat (96 C selama 2 menit), selanjutnya sebanyak 25 siklus dengan ketentuan denaturasi (96 C selama 10 detik); annealing (50 C selama 5 detik); dan extension (60 C selama 4 menit). Hasil PCR dipurifikasi dan disekuen menggunakan primer 27F 5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3' dan 1492R 5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3'. Sekuen dianalisis secara otomatis (ABI 3130XL, Applied Biosystem). Analisa Data BLAST Homologi Analisis sekuen DNA isolat bakteri terbaik dibandingkan dengan sekuen DNA pada basis data (data base) DNA. Penelusuran dilakukan menggunakan internet melalui program pelacakan data base Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) pada National Center for 17
Biotechnology Information, National Institute for Health, USA (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul dkk, 1997). Analisa Filogenetik Analisis filogenetik bakteri dilakukan dengan membandingkan sekuen bakteri terdekat dengan sekuen 16S rdna bakteri target pada data base Gen Bank. Analisis BLAST dilakukan menggunakan bakteri pembanding sebagai out group. Sekuen diolah dengan program ClustalX. Program ClustalX diaktifkan dan ditentukan model Multiple Alignment Mode, kemudian ditekan File dan Load Sequences lalu dipilih data sekuen yang ada. Langkah selanjutnya ditekan Alignment dan dipilih Do Complete Alignment, kemudian ditekan tombol Align sehingga keluar ALN dan DND file. Tekan Trees dan ceck list exsclude Positions with Gaps kemudian dipilih Bootstrap N-J Tree dan tekan OK, sehingga keluar PHB file. Terakhir, dibuka program njplot dan pilih Full Tree pada bagian Operation dan Bootstrap values pada bagian Display. Buka file lalu Open dan pilih PHB file yang telah dibuat tadi. Setelah itu akan keluar pohon filogenik, langkah terakhir edit dan copy, lalu paste di program Microsoft Word (Isnansetyo dan Kamei, 2003). 18
Seleksi β-karoten dengan Ekstraksi dan Spektroskopi UV-Tampak Sampel dalam kultur agar dikerok secara hati-hati kemudian dilarutkan kedalam aquades steril dan di presipitasi menggunakan refrigerated sentrifuge (4 C, 10.000 rpm, 10 menit). Pelet yang diperoleh kemudian ditimbang sebanyak 0.4210 g dan kadar air diukur menggunakan moisture balance (Shimadzu Kyoto) (kadar air 47,0%). Sampel yang sudah ditimbang kemudian dimasukan ke dalam conical bottom tube dan ditambahkan 10 ml aseton 100%. Ekstraksi dilakukan menggunakan vortex (IKA Vortex) skala 6 selama 4 menit. Ekstraksi dilakukan dalam kondisi inert dalam atmosfer gas N2 (UHP grade) dan pencahayaan merah. Ekstraksi diulang sebanyak dua kali hingga pelet tidak berwarna. Ekstrak pigmen kemudian disaring dengan nylon filter (Whatman, 0.2 µm) kemudian dikeringkan menggunakan gas N2. Kemudian seleksi bakteri dilanjutkan dengan mengamati spektrum ekstrak kasarnya yang dilarutkan dalam aseton menggunakan spektrofotometer ultraviolettampak berkas rangkap Varian Cary 50 pada panjang gelombang 300 800 nm. 19
Karakterisasi β-karoten dengan KCKT Untuk analisa karakterisasi pigmen, ekstrak pigmen kering kemudian dilarutkan kembali dalam 0.5 ml aseton dan siap untuk diinjeksi dalam analisa KCKT. Metode KCKT yang digunakan mengacu pada metode Hegazi dkk. (1998). Data KCKT dan spektra serapan dari pengukuran β-karoten digambarkan dengan Program Origin Pro 8.1. Identifikasi β-karoten dengan UV-Tampak Isolasi β-karoten dilakukan dengan menampung pigmen murni saat puncaknya muncul di kromatogram analisa KCKT pada menit-menit terakhir (60,24 menit). Pigmen murni kemudian dikeringkan dengan gas N2 dan dilarutkan ke dalam pelarut aseton, etanol, dan n- heksana dan diukur menggunakan spektrofotometer 1700 pada panjang gelombang 300-500 nm (Shimadzu, Kyoto). Kuantifikasi Kandungan β-karoten Metode kuantifikasi dilakukan dengan menggunakan metode analisa multi-kromatogram (Indrawati dkk., 2013) parameter luas puncak yang 20
dideteksi pada panjang gelombang 450 nm hingga 600 nm dengan rentang selisih 1 nm. Nilai rata-rata luas puncak kemudian di masukan dalam persamaan garis : Y = 0,0108X + 12.677 (Limantara dkk., 2013) Dimana : X = Luas puncak serapan Y = Konsentrasi (mikrogram/ml) 21