BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitian Metode penelitian yang dilakukan adalah eksperimental laboratorium untuk memperoleh data hasil. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu pembuatan ekstrak klorofrom daun salam, uji antioksidan daun salam dan uji antioksidan sediaan SNEDDS daun salam. Dalam penelitian ini terdapat beberapa variabel antara lain sebagai berikut : a. Variabel bebas dalam penelitian ini yaitu perbandingan konsentrasi sediaan SNEDDS ekstrak klorofrom daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp). b. Variabel tergantung dalam penelitian ini yaitu persen (%) aktivitas antioksidan dan nilai IC 50. c. Variabel kendali dalam penelitian ini yaitu metode uji aktivitas antioksidan (DPPH), panjang gelombang, alat yang digunakan dan tempat penelitian. 3.2 Tempat dan Waktu Penelitian Waktu penelitian uji aktivitas antioksidan ekstrak daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) dan sediaan SNEDDS ekstrak daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) dengan menggunakan metode DPPH (1,1-Diphenyil-2-picrylhidrazyl) dilakukan pada bulan Maret 2016. Tempat penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Farmasi Universitas Sebelas Maret untuk preparasi sampel dan Laboratorium 29
30 MIPA Terpadu FMIPA UNS untuk uji aktivitas antioksidan ekstrak daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) dan sediaan SNEDDS ekstrak daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) dengan menggunakan metode DPPH (1,1-Diphenyil-2-picrylhidrazyl). 3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat yang digunakan Alat yang digunakan adalah : Blender, alat timbang, bejana maserasi, batang pengaduk, gelas ukur (Pyrex) 10 ml dan 100 ml, gelas beaker (Pyrex) 250 ml, 500 ml dan 1000 ml, corong buchner, Waterbath, kompor listrik, cawan porselin, erlemenyer (Pyrex) 1000 ml, chamber, labu ukur (Pyrex) 10 ml, 50 ml dan 100 ml, seperangkat alat spektrofotometer UV-Visibel double beam, timbangan analitik, flakon 10mL, pipet tetes, pipet volume (Pyrex) 1 ml, glasfin, mikro pipet (Finnpipette), corong, tabung reaksi (Pyrex), dan rak tabung reaksi. 3.3.2 Bahan yang digunakan: Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : daun salam dari daerah Klaten, klorofrom (Brataco), PEG (Brataco), tween 80 (Brataco), fase minyak PKO (Brataco), methanol p.a (Merck), DPPH(1,1- Diphenyil-2-picrylhidrazyl).
31 3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Determinasi Determinasi daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) dilakukan di Laboratorium biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret. 3.4.2 Pembuatan Serbuk Simplisia Daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) dibersihkan dan dicuci. Daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) yang sudah bersih dikeringkan didalam oven, kemudian diserbuk dengan menggunakan blender untuk menghaluskan simplisia. 3.4.3 Ekstraksi (Maserasi) Daun salam (Syzygium polyanthum Wight Walp) yang sudah bersih kemudian dikeringkan, dan diserbuk menggunakan blender. Serbuk simplisa daun salam ditimbang sebanyak 500 gram dengan timbangan digital. Untuk proses maserasi 500 gram serbuk simplisia daun salam direndam dalam pelarut kloroform sebanyak 4 L. Bejana maserasi ditutup dan didiamkan selama 5 hari. Setelah 5 hari, maserat disaring menggunakan melalui corong kaca yang sudah dilengkapi dengan kain flannel untuk memisahkan maserat dengan serbuk simplisia. Maserat daun salam yang diperoleh dievaporasi menggunakan rotary evaporator dengan suhu 55 o C dan kecepatan rotary 6 hingga volume maserat yang dievaporasi berkurang sekitar sepertiganya. Setelah itu
32 maserat yang telah dievaporasi dengan rotary evaporator dipanaskan diatas waterbath hingga menjadi ekstrak kental. 3.4.4Pembuatan sediaan SNEDDS Formula : Tabel III. Formula sediaan SNEDDS Bahan Konsentrasi (ml) Ekstrak daun salam 0,15 gr Tween 80 1,6 ml PEG 2,4 ml Minyak PKO 1 ml Cara Pembuatan : (Nurona, 2016) 1. Menyiapkan dan menimbang semua bahan yang dibutuhkan. 2. Mencampurkan semua bahan yang sudah ditimbang kemudian di dihomogenkan dengan magnetic stirer selama 30 menit. 3. Kemudian disonikator selama 15 menit, dikondisikan dalam waterbath pada suhu 45 C selama 10 menit. 4. Setelah selesai sediaan nanoemulsi didiamkan selama 24 jam dalam suhu ruang (Nurona, 2016). 3.4.5 Uji Antioksidan dengan peredaman warna DPPH a. Pembuatan Larutan DPPH Untuk pembuatan larutan DPPH yang akan digunakan sebagai pereaksi pada sampel, diambil sebanyak 4 mg DPPH dilarutkan menggunakan metanol p.a kedalam labu ukur 100 ml hingga tanda batas, sehingga konsentrasi DPPH yang digunakan adalah 40 ppm.
33 b. Penentuan panjang gelombang maksimal Penentuan panjang gelombang maksimal dilakukan dengan memasukan 3 ml DPPH 40 ppm ke dalam kuvet kemudian diukur absorbansinya pada rentang panjang gelombang 400-800 kemudian dilihat nilai absorbansi tertingginya. 3.4.6 Uji kuantitatif antioksidan a. Penyiapan larutan kontrol Vitamin C Larutan kontrol berupa larutan Vitamin C injeksi 1000mg/mL atau sama dengan 100.000 ppm kemuadian dilakukan pengenceran dengan berbagai konsentrasi yaitu 1,25; 2,5; 5; 7,5; 10 ppm. Dengan memipet larutan induk berturut turut sebanyak 62,5 µl; 125 µl; 250 µl; 375 µl dan 500 µl dimasukan pada labu ukur 5 ml dan diencerkan dengan metanol p.a hingga batas. Kemudian diambil 2 ml masing- masing konsentrasi dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 ml DPPH 40 ppm hingga homogen kemudiaan diukur panjang gelombang dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS. b. Penyiapan larutan sampel ekstrak Dibuat larutan induk ekstrak kloroform daun salam dengan cara melarutkan 10 mg ekstrak kental kedalam 100 ml metanol p.a sehingga diperoleh larutan induk dengan konsentrasi 100 ppm, kemudian dilakukan pengenceran kedalam labu ukur 10 ml dengan variasi konsentrasi 12,5; 25; 50; 75 dan 100 ppm. Dengan
34 memipet larutan induk berturut turut sebanyak 1,25 ml; 2,5 ml; 5 ml; 7,5 ml dan 1 ml dimasukan pada labu ukur 10 ml dan diencerkan dengan metanol p.a hingga batas. c. Penyiapan larutan sediaan SNEDDS Sediaan SNEDDS konsentrasi 30.000 ppm kemudian dilakukan pengenceran kedalam labu ukur 10 ml dengan variasi konsentrasi 12,5; 25; 50; 75 dan 100 ppm. Dengan memipet larutan induk berturut turut sebanyak 4,16µL; 8,33µL; 16,67µL; 25µL; dan 33,33µL kemudian dimasukkan pada labu ukur 10 ml dan diencerkan dengan metanol p.a hingga batas. d. Pengukuran serapan (absorbansi) peredaman radikal bebas DPPH Masing-masing larutan uji (larutan sampel dan larutan kontrol) dipipet sebanyak 2 ml ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 ml larutan pereaksi (DPPH 40 ppm). Kemudian dikocok dihomogen dan dibiarkan 30 menit. Kemudian diukur dan diamati absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-VIS. 3.5 Pengumpulan dan analisis data Data yang didapatkan berupa nilai absorbansi dari DPPH kontrol, ekstrak, sediaan SNEDDS dan larutan vitamin C. Perhitungan daya antioksidan atau kapasitas antiradikal bebas DPPH diukur dari peredaman warna ungu DPPH, yang dinyatakan dengan persen (%) peredaman yang dinyatakan dalam rumus:
35 % aktivitas antioksidan = Keterangan: Abs DPPH kontrol = Absorbansi DPPH sebelum direaksikan dengan sampel. Abs sisa DPPH = Absorbansi DPPH setelah direaksikan dengan sampel. Dari harga persentase (%) peredaman yang diperoleh, selanjutnya ditentukan nilai IC 50, IC 50 yaitu konsentrasi efektif yang dibutuhkan untuk menangkap 50 % radikal DPPH. Uji signifikasi data yang diperoleh dari hasil pengujian diuji normalitasnya dengan uji Shapiro-Wilk, data yang terdistribusi normal dilanjutkan dengan uji Independent T Test.
36 4 Diagram Alir Cara Kerja a. Pembuatan ekstrak kloroform daun salam 700 gram daun salam Disortasi dan dilakukan penghalusan sehingga diperoleh 500 gram daun salam Dimaserasi dengan 4000 ml kloroform selama 5x 24jam Disaring sehingga diperoleh filtrat Sisa ampas Diremaserasi dengan 1000 ml etanol 70% selama 1x 24jam Disaring sehingga diperoleh filtrat Sisa ampas Ekstrak kental Diuapkan diatas WB, sehingga diperoleh dilakukan Kontrol kualitas ekstrak Uji antioksidan meliputi Bau, warna, bentuk, dan perhitungan rendemen
37 b. Uji kuantitatif antioksidan (1) Pembuatan larutan DPPH 5 mg DPPH dimasukan Labu ukur 50ml Ditambahkan Metanol pa ad tanda batas dikocok Ad homogen diperoleh Larutan DPPH 100ppm (2) Penentuan panjang gelombang maksimal 3 ml larutan DPPH 100ppm dimasukan Tabung reaksi Ditambahkan 3 ml metanol dikocok Ad homogen Diukur Serapannya pada panjang gelombang 400-800 nm dengan spektrofotometer UV-Vis Diketahui Panjang gelombang maksimal
38 (3) Penyiapan larutan kontrol vitamin C 0,5 ml vitamin C (100mg/ml) Dibuat Larutan Vitamin C 100 ppm Dilakukan pengenceran dalam labu ukur 10 ml dengan variasi konsentrasi larutan vitamin C 2 ppm 4 ppm 6 ppm 8 ppm 10 ppm (4) Penyiapan larutan sampel ekstrak tunggal 10 mg ekstrak kental 10 ml metanol Dilarutkan dalam diperoleh Larutan sampel 1000 ppm Dilakukan pengenceran dalam labu ukur 10 ml dengan variasi konsentrasi sampel 12,5 ppm 25 ppm 50 ppm 75 ppm 100 ppm
39 (5) Pengukuran serapan (absorbansi) peredaman radikal bebas DPPH ekstrak tunggal 2 ml Masing-masing larutan uji (larutan sampel ekstrak tunggal, larutan kontrol vitamin C ditambahkan 1 ml larutan DPPH 100ppm Dihomogenkan dan didiamkan Selama 30 menit Diukur Absobansinya pada λ maks (6) Pengukuran serapan (absorbansi) peredaman radikal bebas DPPH pada kombinasi ekstrak 2 ml Masing-masing larutan uji dengan perbandingan kombinasi ¼ IC 50 : ¼ IC 50 ; ¼ IC 50 : ½ IC 50 ; ½ IC 50 : ½ IC 50 ; ½ IC 50 : ¼ IC 50 ditambahkan 1 ml larutan DPPH 100ppm Selama 30 menit Absobansinya pada λ maks
40 5 Jadwal penelitian No Kegiatan Bulan Ke- 1 Studi Pustaka 2 Determinasi 3 Pencarian bahan 4 Ekstrasi dan standarisasi ekstrak 5 Uji daya antioksidan 6 Pengolahan dan analisis data 7 Penyusunan Laporan I II III IV